Dažādu augstas izšķirtspējas mikroskopijas metožu salīdzinājums
Parastajā gaismas mikroskopijā gaismas difrakcija ierobežo attēlveidošanas izšķirtspēju līdz aptuveni 250 nm. Mūsdienās ar superizšķirtspējas paņēmieniem to var uzlabot vairāk nekā 10 reizes. Šo paņēmienu galvenokārt panāk, izmantojot trīs metodes: vienas molekulas lokalizācijas mikroskopiju, tostarp gaismjutīgās lokalizācijas mikroskopiju (PALM) un stohastisko optiskās rekonstrukcijas mikroskopiju (STORM); strukturētā apgaismojuma mikroskopija (SIM); un stimulētās emisijas samazināšanās mikroskopija (STED). Visiem rūp tas, kā izvēlēties superizšķirtspējas tehnoloģiju. "Diemžēl nav vienkāršu principu, lai izlemtu, kuru metodi izmantot," saka Mathew Stracy, pēcdoktorantūras pētnieks Oksfordas Universitātē, Apvienotajā Karalistē. "Katram ir savas priekšrocības un trūkumi." Zinātnieki, protams, arī izdomā, kā izvēlēties pareizo metodi konkrētam projektam. "Bioattēlveidošanas kontekstā galvenie faktori, kas jāņem vērā, ir: telpiskā un laika izšķirtspēja, jutība pret fotobojājumiem, marķēšanas spēja, parauga biezums un fona fluorescence vai šūnu autologā fluorescence." Kā tas darbojas Dažādi augstas izšķirtspējas mikroskopi darbojas dažādos veidos. PALM un STORM gadījumā tikai neliela daļa fluorescējošu marķieru tiek ierosināti vai fotoaktivēti noteiktā brīdī, ļaujot tos neatkarīgi lokalizēt ar augstu precizitāti. Veicot šo procesu ar visām fluorescējošām etiķetēm, tiek iegūts pilnīgs superizšķirtspējas attēls. Stefans Hells, viens no 2014. gada Nobela prēmijas ķīmijā laureātiem un Maksa Planka Biofizikālās ķīmijas institūta direktors, sacīja: "Sistēmu PALM/STORM ir salīdzinoši viegli iestatīt, taču to ir grūti piemērot, jo fluorescējošā spuldze grupai ir jābūt fotoaktivācijas spējai. Ierobežojumi Trūkums ir tāds, ka tiem ir nepieciešams noteikt vienu fluorescējošu molekulu šūnas kontekstā, un tie ir mazāk uzticami nekā STED. STED izmanto lāzera impulsu, lai ierosinātu fluoroforu, un gredzenveida lāzeru, lai dzēstu fluoroforu, atstājot tikai starpposma nanometra izmēra fluorescenci superizšķirtspējai. Skenējot visu paraugu, tiek iegūts attēls. "STED priekšrocība ir tā, ka tā ir spiedpogu tehnoloģija," paskaidroja Hells. "Tas darbojas kā standarta konfokālās fluorescences mikroskops." Tas var arī attēlot dzīvas šūnas, izmantojot fluoroforus, piemēram, zaļus vai dzeltenus fluorescējošos proteīnus un no rodamīna iegūtās krāsvielas. Parametru salīdzinājums Lai gan visas superizšķirtspējas metodes izšķirtspējas ziņā pārspēj parasto gaismas mikroskopiju, tās atšķiras viena no otras. SIM karte aptuveni divkāršo izšķirtspēju līdz aptuveni 100 nm. PALM un STORM var atrisināt 15 nm mērķus. Saskaņā ar Hell, STED nodrošina telpisko izšķirtspēju 30 nm dzīvās šūnās un 15 nm fiksētās šūnās. Runājot par konkrētiem lietojumiem, jāņem vērā arī signāla un trokšņa attiecība. Dažos gadījumos zemāka izšķirtspēja, bet augstāka SNR var radīt labāku attēlu nekā pretējā gadījumā (augstāka izšķirtspēja, bet zemāka SNR). Ļoti svarīgs ir arī attēla iegūšanas ātrums, īpaši dzīvām šūnām. "Visas superizšķirtspējas metodes ir lēnākas nekā parastās fluorescences attēlveidošanas metodes," sacīja Stracy. "PALM/STORM ir vislēnākais, tai ir nepieciešami desmitiem tūkstošu kadru, lai iegūtu vienu attēlu, SIM ir nepieciešami desmitiem kadru, un STED ir skenēšanas tehnoloģija, tāpēc iegūšanas ātrums ir atkarīgs no redzes lauka lieluma." Papildus dzīvām šūnām vai fiksētām attēlveidošanas šūnām daži zinātnieki vēlas arī saprast, kā objekti pārvietojas. Stracy ir ieinteresēts izprast bioloģisko sistēmu dinamiku dzīvās šūnās, nevis tikai statiskus attēlus. Viņš apvieno PALM ar vienas daļiņas izsekošanu, lai analizētu dzīvu šūnu dinamiku. Tādā veidā viņš var tieši izsekot marķiera molekulām, kad tās pilda savas funkcijas. Tomēr viņš uzskata, ka SIM nav piemērota šo dinamisko procesu pētīšanai molekulārā līmenī, bet tā ātrā iegūšanas ātruma dēļ tā ir īpaši piemērota lielāku struktūru, piemēram, veselu hromosomu, dinamikas novērošanai. Jaunākie rezultāti 2017. gadā Hell's komanda ziņoja par MINFLUX superizšķirtspējas mikroskopu zinātnē. Saskaņā ar Hellu, šī superizšķirtspējas metode pirmo reizi sasniedz telpisko izšķirtspēju 1 nm. Turklāt tas var izsekot atsevišķas molekulas dzīvās šūnās vismaz 100 reizes ātrāk nekā citas metodes. Arī citi zinātnieki atzinīgi novērtēja MINFLUX mikroskopu. "Nepārtraukti tiek izstrādātas jaunas lietojumprogrammas un pieejas, taču mani izceļas divi sasniegumi," sacīja Šetmens. Viens no tiem ir MINFLUX. "Tā izmanto ģeniālu pieeju, lai iegūtu ļoti precīzu molekulāro pozicionēšanu." Runājot par otro aizraujošo attīstību, Shechtman pieminēja WE Moerner un viņa kolēģus Stenfordas universitātē. Moerner bija arī 2014. gada Nobela prēmijas ķīmijā saņēmējs. Viens no uzvarētājiem. Lai novērstu attēlveidošanas izšķirtspējas ierobežojumus, ko izraisa fluorescējošu atsevišķu molekulu anizotropā izkliede, zinātnieki izmantoja dažādas ierosmes polarizācijas, lai noteiktu molekulu orientāciju un stāvokli. Turklāt viņiem ir izveidotas smalkas zīlīšu virsmas. Šīs metodes uzlabo spēju lokalizēt struktūras. Par fluorescējošām etiķetēm Daudzos īpaši augstas izšķirtspējas lietojumos etiķetēm patiešām ir nozīme. Ir arī daži uzņēmumi, kas nodrošina saistītos produktus. Piemēram, Vācijas uzņēmums Miltenyi ir sadarbojies ar Stefana Hella dibināto uzņēmumu Abberior, lai nodrošinātu pielāgotus antivielu konjugācijas pakalpojumus augstas izšķirtspējas mikroskopijas krāsām. Vairāki citi uzņēmumi piedāvā arī atbilstošus marķierus. "Mūsu nanopastiprinātāji ir ļoti mazi, tikai 1,5 kDa un ļoti specifiski," saka Kristofs Ekerts, ChromoTek mārketinga darbinieks. Šīs olbaltumvielas saistās ar zaļām un sarkanām fluorescējošām olbaltumvielām (GFP un RFP). Tie ir iegūti no alpakas antivielu fragmentiem, kas pazīstami kā VHH vai nanoķermeņi, ar lieliskām saistīšanās īpašībām un stabilu kvalitāti bez partijām uz partijām. Šie marķieri ir piemēroti dažādām augstas izšķirtspējas tehnikām, tostarp SIM, PALM, STORM un STED. Ai-Hui Tang, Merilendas Universitātes Medicīnas skolas docents, un kolēģi izmantoja ChromoTek GFP-Booster un STORM, lai izpētītu informācijas izplatīšanos nervu sistēmā. Viņi atrada molekulāros nanoklasterus, ko sauc par nanokolonnām, presinaptiskajos un postsinaptiskajos neironos. Zinātnieki uzskata, ka šī struktūra parāda, ka centrālā nervu sistēma izmanto vienkāršus principus, lai uzturētu un regulētu sinaptisko efektivitāti. Dažādas superizšķirtspējas attēlveidošanas versijas un arvien vairāk metožu ieved zinātniekus vēl dziļāk bioloģiskos noslēpumos. Pārkāpjot redzamās gaismas difrakcijas robežu, biologi var pat "cieši uzraudzīt" šūnu darbību.
