Mikroorganismu skaita noteikšana - mikroskopa tiešās skaitīšanas metode!
Baktēriju populācijas pieaugums izpaužas kā šūnu skaita palielināšanās vai šūnu masas palielināšanās. Šūnu skaita noteikšanas metodes ietver tiešās mikroskopa skaitīšanas metodi, plākšņu koloniju skaitīšanas metodi, fotoelektriskās eļļas attiecības metodi, maksimālās varbūtības metodi un membrānas filtrēšanas metodi. Šūnu vielas mērīšanas metodes ietver šūnu sausnas masas noteikšanu, noteiktu šūnu komponentu, piemēram, slāpekļa, RNS un DNS satura noteikšanu, kā arī metabolītu noteikšanu. Īsāk sakot, ir daudzas metodes mikroorganismu augšanas mērīšanai, katrai no tām ir savas priekšrocības un trūkumi, un tās jāizvēlas atbilstoši konkrētajai situācijai. Šis eksperiments galvenokārt iepazīstina ar mikroskopa tiešās skaitīšanas metodi, ko parasti izmanto ražošanā un zinātniskajos pētījumos.
1. Mērķa prasības
1. Precizēt asins šūnu skaita principu.
2. Apgūt mikroorganismu skaitīšanas metodi, izmantojot asins šūnu skaitītāju.
2. Pamatprincipi
Mikroskopa tiešās skaitīšanas metode ir vienkārša, ātra un intuitīva metode, lai tieši saskaitītu nelielu testējamā parauga suspensijas daudzumu uz īpaša stikla priekšmetstikliņa ar noteiktu laukumu un tilpumu (pazīstams arī kā baktēriju skaitītājs). Metodes. Pašlaik mājās un ārvalstīs plaši izmantotie baktēriju skaitītāji ir: asins šūnu skaitīšanas dēlis, Peteroff-Hauser baktēriju skaitītājs un Hawksley baktēriju skaitītājs utt. Tos var izmantot rauga, baktēriju, pelējuma sporu un citu suspensiju skaitīšanai, pamatprincips ir tas pats. Pēdējo divu veidu baktēriju skaitītāju kopējais tilpums ir 0.02 mm3 pēc pārklājuma ar vāka stiklu, un attālums starp vāka stiklu un priekšmetstikliņu ir tikai 0,02 mm, tāpēc eļļa iegremdējamo objektīvu var izmantot, lai novērotu un novērotu mazas šūnas, piemēram, baktērijas. skaitīt. Papildus šiem bakteriometriem pastāv arī uztriepes laukuma un tieši zem mikroskopa redzamā redzes lauka attiecības novērtēšanas metode, ko parasti izmanto piena bakterioloģiskai izmeklēšanai. Mikroskopa tiešās skaitīšanas metodes priekšrocības ir intuitīvas, ātras un viegli lietojamas. Tomēr šīs metodes trūkums ir tāds, ka izmērītais rezultāts parasti ir mirušo un dzīvo šūnu summa. Pašlaik ir dažas metodes, lai novērstu šo trūkumu, piemēram, dzīvotspējīgu baktēriju krāsošanu mikrokameru kultūrā (īsu laiku) un šūnu dalīšanās inhibitoru pievienošanu, lai sasniegtu mērķi skaitīt tikai dzīvotspējīgas baktērijas.
Šajā eksperimentā hemocitometrs tika izmantots kā piemērs tiešai mikroskopiskai skaitīšanai. Lai izmantotu pārējos divu veidu baktēriju skaitītājus, lūdzu, skatiet katra ražotāja norādījumus. Skaitīšana tieši zem mikroskopa ar hemocitometru ir plaši izmantota mikroorganismu skaitīšanas metode. Skaitīšanas plāksne ir speciāls stikla slaids, uz kura četras spraugas veido trīs platformas; platākā platforma vidū ir sadalīta divās daļās ar īsu šķērsvirzienu, un katrā platformas pusē ir režģis. Katrs režģis ir sadalīts deviņos lielos kvadrātos, un lielais kvadrāts vidū ir skaitīšanas telpa. Asins šūnu skaitīšanas plāksnes struktūra ir parādīta l{{{{10}}}} attēlā. Skaitīšanas telpas mērogiem parasti ir divas specifikācijas: viens ir liels kvadrāts, kas sadalīts 25 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 16 mazos kvadrātos (attēls 15-2); otrs ir liels laukums. Laukums ir sadalīts 16 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 25 mazos lauciņos, taču neatkarīgi no tā, kāda veida skaitīšanas dēlis tas ir, katrā lielajā kvadrātā ir 400 mazi kvadrāti. Katra lielā kvadrāta malas garums ir 1 mm, un katra lielā kvadrāta laukums ir 1 mm2. Pēc pārklāšanas ar vāka stiklu augstums starp vāka stiklu un priekšmetstikliņu ir 0,1mm, tātad skaitīšanas kameras tilpums ir 0,lmm3 (viena tūkstošdaļa mililitra). Attēls 15-1 Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra (1) Attēls 15-2 Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra (2) A. Skats no priekšas; B. Garengriezuma skats; Palielināts režģis, lielais kvadrāts vidū ir skaitīšanas kamera 1. Asins šūnu skaitīšanas plate; 2. Vāks stikls; 3. Skaitot skaitīšanas kamerā, parasti saskaitiet kopējo baktēriju skaitu piecos kvadrātos, pēc tam aprēķiniet katra kvadrāta vidējo lielumu un reiziniet ar 25 vai 16, lai iegūtu Kopējo baktēriju skaitu lielā kvadrātā pārvērš kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma. Lai kopējais baktēriju skaits piecos kvadrātos ir A un baktēriju šķīduma atšķaidīšanas koeficients ir B. Ja tā ir skaitīšanas plāksne ar 25 kvadrātiem, kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(gab.) Tāpat, ja tā ir skaitīšanas plāksne ar 16 vidējiem kvadrātiem, kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma=A/ 5×16×104×B=32000A·B (gabalos)
3. Aprīkojums
1. Baktērijas
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenti vai citi trauki
Hemocitometrs, mikroskops, segstikliņš, sterils kapilārais pilinātājs.
4. Darbības soļi
1. Baktēriju suspensijas pagatavošana
Saccharomyces cerevisiae tika sagatavots atbilstošas koncentrācijas baktēriju suspensijā ar sterilu fizioloģisko šķīdumu.
2. Mikroskopa skaitīšanas telpa
Pirms paraugu pievienošanas mikroskopiski pārbaudiet skaitīšanas plāksnes skaitīšanas kameru. Ja ir netīrumi, pirms skaitīšanas tie ir jānotīra un jāizžāvē.
3. Pievienojiet paraugu
Nosedziet tīru un sausu hemocitometru ar segstikliņu un pēc tam izmantojiet sterilu kapilāro pilinātāju, lai no pārklājošā stikla malas pilinātu nelielu pilienu sakratītās Saccharomyces cerevisiae suspensijas un ļaujiet baktēriju šķīdumam automātiski pārvietoties pa spraugu ar kapilārās osmozes palīdzību. Ieejot skaitīšanas telpā, vispārējo skaitīšanas telpu var piepildīt ar baktēriju šķidrumu. Ņemot paraugus, vispirms sakratiet baktēriju šķīdumu; pievienojot paraugus, skaitīšanas kamerā nedrīkst rasties gaisa burbuļi.
4. Skaitīšana mikroskopā
Pēc parauga pievienošanas 5 minūtes stāviet nekustīgi, pēc tam novietojiet hemocitometru uz mikroskopa skatuves, vispirms ar mazjaudas mikroskopu atrodiet skaitīšanas kameras atrašanās vietu un pēc tam skaitīšanai pārslēdzieties uz lieljaudas mikroskopu. Atbilstoši noregulējiet mikroskopa gaismas intensitāti. Mikroskopiem, kuros apgaismojumam tiek izmantoti spoguļi, pievērsiet uzmanību, lai nenovirzītos no vienas gaismas puses, pretējā gadījumā redzamības laukā nebūs viegli skaidri saskatīt skaitīšanas telpas kvadrātveida līnijas, vai arī būs redzamas tikai vertikālas vai horizontālas līnijas. būt redzamam. Ja pirms skaitīšanas tiek konstatēts, ka baktēriju šķīdums ir pārāk koncentrēts vai pārāk atšķaidīts, pirms skaitīšanas ir nepieciešams atkārtoti pielāgot atšķaidījumu. Parasti parauga atšķaidīšanai katrā mazajā šūnā ir nepieciešamas apmēram 5 līdz 10 baktērijas. Katrā skaitīšanas kamerā skaitīšanai tiek atlasītas 5 vidējās šūnas (pēc izvēles 4 stūri un viena vidējā šūna centrā). Šūnas, kas atrodas uz režģa līnijas, parasti tiek skaitītas tikai augšējā un labajā rindā. Rauga pumpuru veidošanās gadījumā, kad pumpura izmērs sasniedz pusi no mātes šūnas, tas tiek skaitīts kā divas baktēriju šūnas. Lai saskaitītu paraugu, aprēķina baktēriju saturu paraugā, aprēķinot vidējo vērtību no divām skaitīšanas kamerām.
5. Nomazgājiet asins šūnu skaitu
Pēc lietošanas izskalojiet asins šūnu skaitīšanas dēli ar ūdeni krānā, neberziet ar cietiem priekšmetiem un pēc mazgāšanas nosusiniet to pats vai ar fēnu. Mikroskopiskā pārbaude, lai novērotu, vai katrā mazajā šūnā ir atlikušas baktērijas vai citi nosēdumi. Ja tas nav tīrs, tas ir atkārtoti jāmazgā, līdz tas ir tīrs.
