Mikroorganismu skaita noteikšana-Mikroskopiskā tiešās skaitīšanas metode!
Baktēriju populācijas pieaugums izpaužas kā šūnu skaita palielināšanās vai šūnu materiāla palielināšanās. Šūnu skaita noteikšanas metodes ietver tiešo mikroskopisko skaitu, plākšņu skaitu, duļķainuma novērtēšanu ar spektrofotometru, visticamāko MPN skaitu un membrānas filtrēšanu. (membrānas filtrēšana) utt. Šūnu vielu mērīšanas metodes ietver šūnu sausnas masas noteikšanu, noteiktu šūnu komponentu, piemēram, slāpekļa satura, RNS un DNS satura noteikšanu, un metabolītu produktu noteikšanu. Īsāk sakot, ir daudzas metodes mikrobu augšanas mērīšanai, katrai no tām ir savas priekšrocības un trūkumi. Metode jāizvēlas atbilstoši konkrētajām darba prasībām. Šis eksperiments galvenokārt iepazīstina ar mikroskopa tiešās skaitīšanas metodi, ko parasti izmanto ražošanas un zinātniskās pētniecības darbā.
1. Mērķa prasības
1. Precizējiet skaitīšanas principu ar asins šūnu skaitīšanas dēli.
2. Apgūt mikroorganismu skaitīšanas metodi, izmantojot asins šūnu skaitīšanas dēli.
2. Pamatprincipi
Mikroskopa tiešās skaitīšanas metode ir vienkārša, ātra un intuitīva metode, kas uz speciāla priekšmetstikliņa ar noteiktu laukumu un tilpumu (ko sauc arī par bakteriometru) novieto nelielu testējamā parauga suspensijas daudzumu un saskaita to tieši zem mikroskopa. Metodes. Pašlaik mājās un ārzemēs plaši izmantotie bakteriometri ir: hemocitometrs, Peteroff-Hauser bakteriometrs un Hawksley bakteriometrs uc Tos visus var izmantot rauga, baktēriju, pelējuma sporu un citu suspensiju skaitīšanai, un pamatprincipi ir vienādi. Pēdējo divu baktēriju skaitītāju kopējais tilpums ir 0.02 mm3 pēc pārklājuma ar vāka stiklu, un attālums starp vāka stiklu un priekšmetstikliņu ir tikai 0,02 mm. Tāpēc eļļas imersijas objektīvu var izmantot, lai novērotu un noteiktu mazākas šūnas, piemēram, baktērijas. skaitīt. Papildus šo bakteriometru izmantošanai ir arī novērtēšanas metode, kas tieši novēro uztriepes laukuma attiecību pret redzes lauka laukumu mikroskopā. Šo metodi parasti izmanto piena bakterioloģiskai izmeklēšanai. Mikroskopa tiešās skaitīšanas metodes priekšrocības ir tādas, ka tā ir intuitīva, ātra un viegli lietojama. Tomēr šīs metodes trūkums ir tāds, ka izmērītais rezultāts parasti ir mirušo baktēriju un dzīvo baktēriju summa. Pašlaik ir dažas metodes, lai novērstu šo trūkumu, piemēram, apvienot dzīvotspējīgas baktērijas, kas iekrāso mikrokameru kultūru (īsu laiku) un pievienojot šūnu dalīšanās inhibitorus, lai sasniegtu mērķi skaitīt tikai dzīvotspējīgas baktērijas.
Šajā eksperimentā kā piemērs tiek izmantots hemocitometrs, lai veiktu tiešu skaitīšanu mikroskopā. Lai izmantotu pārējos divus bakteriometrus, lūdzu, skatiet katra ražotāja norādījumus. Tieša skaitīšana zem mikroskopa, izmantojot hemocitometru, ir plaši izmantota mikrobu uzskaites metode. Skaitīšanas dēlis ir īpašs slīdnis ar četrām rievām, kas veido trīs platformas; platākā platforma vidū ir sadalīta divās daļās ar īsu horizontālu rievu, un katrā platformas pusē ir režģis. Katrs kvadrātveida režģis ir sadalīts deviņos lielos kvadrātos, un lielais kvadrāts vidū ir skaitīšanas telpa. Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra ir parādīta attēlā {{0}}. Skaitīšanas kameras skalai parasti ir divas specifikācijas. Viens ir liels kvadrāts, kas sadalīts 25 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 16 mazos kvadrātos (attēls 15-2); otrs ir liels laukums. Kvadrātveida režģis ir sadalīts 16 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 25 mazos kvadrātos. Tomēr neatkarīgi no tā, kāda veida skaitīšanas dēlis tas ir, katrā lielajā kvadrātā ir 400 mazo kvadrātu. Katra lielā kvadrāta malas garums ir lmm, tad katra lielā kvadrāta laukums ir lmm2. Pēc vāka pārklājuma augstums starp vāku un priekšmetstikliņu ir 0,lmm, tātad skaitīšanas kameras tilpums ir 0,lmm3 (viena desmittūkstošā daļa mililitra). Attēls 15-1 Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra (1) Attēls 15-2 Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra (2) A. Skats no priekšas; B. Garengriezums; palielināts kvadrātveida režģis, lielais kvadrāts vidū ir skaitīšanas kamera 1. Asins šūnu skaitīšanas dēlis; 2. Pārklājums; 3. Skaitot skaitīšanas kamerā, parasti saskaitiet kopējo baktēriju skaitu piecos kvadrātos, pēc tam atrodiet katra kvadrāta vidējo vērtību un reiziniet ar 25 vai 16, lai iegūtu kopējo baktēriju skaitu lielā kvadrātā. kopējā baktēriju skaitā 1 ml baktēriju šķīduma. Pieņemsim, ka kopējais baktēriju skaits piecos vidējos kvadrātos ir A un baktēriju šķīduma atšķaidīšanas koeficients ir B. Ja tā ir skaitīšanas plāksne ar 25 vidējiem kvadrātiem, tad kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (gab.) Tādā pašā veidā, ja tā ir skaitīšanas plāksne ar 16 kvadrātiem, kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (gab.),
