Atšķirība starp fluorescences mikroskopu un parasto mikroskopu
1. Apskatiet apgaismojuma metodi
Fluorescences mikroskopa apgaismojuma metode parasti ir epi-tipa, tas ir, gaismas avots tiek novietots uz testa parauga caur objektīvu.
2. Apskatiet izšķirtspēju
Fluorescences mikroskopi kā gaismas avotu izmanto ultravioleto gaismu ar salīdzinoši īsu viļņa garumu, bet izšķirtspēja ir augstāka nekā parastajiem optiskajiem mikroskopiem.
3, atšķirība filtrā
Fluorescences mikroskops izmanto divus īpašus filtrus, ko izmanto gaismas avota priekšā, lai filtrētu redzamo gaismu, un starp objektīvu un okulāru, lai filtrētu ultravioleto gaismu, kas var aizsargāt cilvēka acis.
Fluorescences mikroskops ir arī optiskā mikroskopa veids, galvenokārt tāpēc, ka fluorescences mikroskopa ierosinātais viļņa garums ir īss, tāpēc tas rada atšķirības fluorescences mikroskopa un parastā mikroskopa struktūrā un lietojumā. Lielākajai daļai fluorescences mikroskopu ir laba funkcija vājas gaismas uztveršanai. , tāpēc ļoti vājas fluorescences apstākļos arī tā attēlveidošanas spēja ir laba. Kopā ar nepārtrauktu fluorescences mikroskopijas uzlabošanu pēdējos gados, arī troksnis ir ievērojami samazināts. Tāpēc arvien vairāk tiek izmantoti fluorescences mikroskopi.
Zināšanas par divu fotonu fluorescences mikroskopiju
Divu fotonu ierosmes pamatprincips ir: augsta fotonu blīvuma gadījumā fluorescējošas molekulas var vienlaikus absorbēt divus gara viļņa fotonus un pēc ļoti īsa tā sauktā ierosinātā stāvokļa dzīves laika izstarot īsa viļņa garuma fotonu. ; efekts ir tāds pats kā izmantojot fotonu, kura viļņa garums ir uz pusi mazāks par garo viļņa garumu, lai ierosinātu fluorescējošu molekulu. Divu fotonu ierosmei nepieciešams augsts fotonu blīvums, un, lai nesabojātu šūnas, divu fotonu mikroskopijā izmanto augstas enerģijas režīma bloķētus impulsu lāzerus. Šis lāzers izstaro lāzera gaismu ar augstu maksimālo enerģiju un zemu vidējo enerģiju, ar impulsa platumu tikai 100 femtosekundes un frekvenci no 80 līdz 100 MHz. Ja impulsa lāzera fotonu fokusēšanai tiek izmantots augstas skaitliskās apertūras objektīvs, fotonu blīvums objektīva fokusa punktā ir visaugstākais, un divu fotonu ierosme notiek tikai objektīva lēcas fokusa punktā, tāpēc divu fotonu mikroskopam nav nepieciešams konfokālais caurums, kas uzlabo fluorescences noteikšanas efektivitāti.
Vispārējā fluorescences fenomenā ierosmes gaismas zemā fotonu blīvuma dēļ fluorescējoša molekula var vienlaikus absorbēt tikai vienu fotonu un pēc tam caur starojuma pāreju izstarot fluorescējošu fotonu, ko sauc par viena fotona fluorescenci. Fluorescences ierosmes procesā ar lāzeru kā gaismas avotu var rasties divu fotonu vai pat vairāku fotonu fluorescences parādība. Šobrīd izmantotā ierosmes gaismas avota intensitāte ir augsta, un fotonu blīvums atbilst prasībai, ka fluorescējošā molekula vienlaikus absorbē divus fotonus. Izmantojot vispārējo lāzeru kā ierosmes gaismas avotu, fotonu blīvums joprojām nav pietiekams, lai radītu divu fotonu absorbciju. Parasti tiek izmantots femtosekundes impulsa lāzers, un tā momentānā jauda var sasniegt megavatus. Tāpēc divu fotonu fluorescences viļņa garums ir īsāks par ierosmes gaismas viļņa garumu, kas ir līdzvērtīgs efektam, ko rada ierosmes uz pusi ierosmes viļņa garums.
Divu fotonu fluorescences mikroskopijai ir daudz priekšrocību:
1) Izkliede mazāk ietekmē gara viļņa garuma gaismu nekā īsa viļņa gaisma, un tā var viegli iekļūt paraugā;
2) fluorescējošās molekulas ārpus fokusa plaknes netiek ierosinātas, lai vairāk ierosmes gaismas varētu sasniegt fokusa plakni, lai ierosmes gaisma varētu iekļūt dziļākos paraugos;
3) gara viļņa tuvējā infrasarkanā gaisma ir mazāk toksiska šūnām nekā īsa viļņa gaisma;
4) Aplūkojot paraugus ar divu fotonu mikroskopiju, fotobalināšana un fototoksicitāte ir tikai fokusa plaknē. Tāpēc divu fotonu mikroskopija ir piemērotāka biezu paraugu apskatei nekā viena fotona mikroskopija, dzīvu šūnu apskatei vai fiksēta punkta fotobalināšanas eksperimentu veikšanai.
Zināšanas par konfokālās fluorescences mikroskopiju
Konfokālās fluorescences mikroskopijas pamatprincips: parauga apgaismošanai izmantojot punktveida gaismas avotu, fokusa plaknē tiek izveidots neliels gaismas plankums ar skaidri noteiktu kontūru. sastāv no staru sadalītāja. Staru sadalītājs nosūta fluorescenci tieši uz detektoru. Gaismas avota un detektora priekšā ir caurums, ko attiecīgi sauc par apgaismojuma caurumu un noteikšanas caurumu. Abu ģeometriskie izmēri ir vienādi, aptuveni 100-200 nm; attiecībā pret gaismas plankumu fokusa plaknē abi ir konjugēti, tas ir, gaismas punkts iziet cauri virknei lēcu un, visbeidzot, vienlaikus var tikt fokusēts uz apgaismojuma adatas caurumu un noteikšanas adatas caurumu. Tādā veidā gaismu no fokusa plaknes var koncentrēt noteikšanas cauruma diapazonā, savukārt izkliedētā gaisma no augšas vai zem fokusa plaknes tiek bloķēta no noteikšanas cauruma un to nevar attēlot. Paraugs tiek skenēts punkts punktā ar lāzeru, un fotopavairotāja caurule pēc cauruma noteikšanas iegūst arī atbilstošā gaismas punkta konfokālo attēlu punktu pa punktam, kas tiek pārveidots digitālā signālā un pārraidīts uz datoru, un visbeidzot tiek apkopots ekrāns pārvēršas skaidrā visas fokusa plaknes konfokālā attēlā. .
Katrs fokusa plaknes attēls faktiski ir parauga optiskais šķērsgriezums, un šim optiskajam šķērsgriezumam vienmēr ir noteikts biezums, ko sauc arī par optisko šķēli. Tā kā gaismas intensitāte fokusa punktā ir daudz lielāka nekā nefokusa punktā un nefokālās plaknes gaismu filtrē caurums, konfokālās sistēmas lauka dziļums ir aptuveni nulle, un skenēšana gar Z-ass var realizēt optisko tomogrāfiju, veidojot Novērojiet divdimensiju optisko sekciju parauga fokusētajā vietā. Apvienojot XY plaknes (fokālās plaknes) skenēšanu ar Z-ass (optiskās ass) skenēšanu, uzkrājot secīgu slāņu divdimensiju attēlus un apstrādājot ar speciālu datorprogrammu, var iegūt parauga trīsdimensiju attēlu.
Tas nozīmē, ka noteikšanas caurums un gaismas avota caurums vienmēr ir fokusēti uz vienu un to pašu punktu, lai ārpus fokusēšanas plaknes ierosinātā fluorescence nevarētu iekļūt noteikšanas caurumā.
Konfokālā lāzera darbības principa vienkāršā izteiksme ir tāda, ka tas izmanto lāzeru kā gaismas avotu, un, pamatojoties uz tradicionālo fluorescences mikroskopa attēlveidošanu, tiek pievienota lāzerskenēšanas ierīce un konjugāta fokusēšanas ierīce, kā arī digitālā attēla iegūšana un apstrāde. sistēmu kontrolē dators.
