Atšķirība starp parasto mikroskopu un fluorescences mikroskopu
Fluorescences mikroskopi izmanto ultravioleto gaismu kā gaismas avotu, lai apstarotu pārbaudāmo objektu, lai objekts izstaro gaismu, un pēc tam novērojiet objektu zem mikroskopa. To galvenokārt izmanto imunofluorescences šūnām. Tas galvenokārt sastāv no gaismas avota, filtra plāksnes sistēmas un optiskās sistēmas, lai novērotu parauga fluorescējošu attēlu, izmantojot okulāra un objektīva palielinājumu. Apskatīsim atšķirību starp šo fluorescences mikroskopu un parasto optisko mikroskopu.
1. Runājot par apgaismojuma metodēm
Fluorescences mikroskopa apgaismojuma metode parasti ir episkopiska, tas ir, gaismas avots tiek projicēts uz testa paraugu caur objektīva lēcu.
2. Izšķirtspējas ziņā
Fluorescences mikroskopi kā gaismas avotu izmanto ultravioleto gaismu. Viļņa garums ir salīdzinoši īss, bet izšķirtspēja ir augstāka nekā parastajiem optiskajiem mikroskopiem.
3. Filtra atšķirība
Fluorescences mikroskopā tiek izmantoti divi speciāli filtri, kas tiek izmantoti gaismas avota priekšā, lai filtrētu redzamo gaismu, un starp objektīvu un okulāru, lai izfiltrētu ultravioleto gaismu, kas var aizsargāt cilvēka acis.
Fluorescences mikroskops ir arī sava veida optiskais mikroskops, galvenokārt tāpēc, ka fluorescences mikroskopa ierosinātais viļņa garums ir īss, tāpēc tas rada atšķirības fluorescences mikroskopa un parastā mikroskopa struktūrā un lietojumā. Lielākajai daļai fluorescences mikroskopu ir laba funkcija vājas gaismas uztveršanai, tāpēc ļoti vājas fluorescences apstākļos arī tā attēlveidošanas spēja ir laba. Kopā ar nepārtrauktu fluorescences mikroskopu uzlabošanu pēdējos gados, troksnis ir arī ievērojami samazināts. Tāpēc arvien vairāk tiek izmantoti fluorescences mikroskopi.
Zināšanas par divu fotonu fluorescences mikroskopiju
Divu fotonu ierosmes pamatprincips ir: augsta fotonu blīvuma gadījumā fluorescējošas molekulas var vienlaikus absorbēt divus fotonus ar garu viļņu garumu un pēc īsa tā sauktā ierosinātā stāvokļa dzīves perioda izstarot īsāka viļņa garuma fotonu. . ; efekts ir tāds pats kā izmantojot fotonu, kura viļņa garums ir puse no garā viļņa garuma, lai ierosinātu fluorescējošu molekulu. Divu fotonu ierosmei nepieciešams augsts fotonu blīvums. Lai nesabojātu šūnas, divu fotonu mikroskopijā tiek izmantoti augstas enerģijas režīmā bloķēti impulsu lāzeri. Šī lāzera izstarotajam lāzeram ir augsta maksimālā enerģija un zema vidējā enerģija, tā impulsa platums ir tikai 100 femtosekundes, un tā frekvence var sasniegt 80 līdz 100 megahercu. Izmantojot augstas skaitliskās apertūras objektīva objektīvu, lai fokusētu impulsa lāzera fotonus, fotonu blīvums objektīva fokusa punktā ir visaugstākais, un divu fotonu ierosme notiek tikai objektīva fokusa punktā, tāpēc divu fotonu mikroskopam nav nepieciešams konfokālais caurums, kas uzlabo fluorescences noteikšanas efektivitāti.
Vispārējās fluorescences parādībās ierosmes gaismas zemā fotonu blīvuma dēļ fluorescējoša molekula var vienlaikus absorbēt tikai vienu fotonu un pēc tam izstarot fluorescējošu fotonu caur starojuma pāreju, kas ir viena fotona fluorescence. Fluorescences ierosmes procesā, izmantojot lāzeru kā gaismas avotu, var rasties divu fotonu vai pat vairāku fotonu fluorescence. Šobrīd izmantotā ierosmes gaismas avota intensitāte ir augsta, un fotonu blīvums atbilst fluorescējošu molekulu prasībām, kas vienlaikus absorbē divus fotonus. Izmantojot vispārējo lāzeru kā ierosmes gaismas avotu, fotonu blīvums joprojām nav pietiekams, lai radītu divu fotonu absorbcijas fenomenu. Parasti tiek izmantots femtosekundes impulsa lāzers, un tā momentānā jauda var sasniegt megavatus. Tāpēc divu fotonu fluorescences viļņa garums ir īsāks par ierosmes gaismas viļņa garumu, kas ir līdzvērtīgs efektam, ko rada ierosme uz pusi no ierosmes viļņa garuma.
Divu fotonu fluorescences mikroskopijai ir daudz priekšrocību:
1) Gara viļņa gaisma ir mazāk ietekmēta izkliedē nekā īsa viļņa gaisma, un tā viegli iekļūst paraugā;
2) fluorescējošās molekulas ārpus fokusa plaknes netiek ierosinātas, lai vairāk ierosmes gaismas varētu sasniegt fokusa plakni, lai ierosmes gaisma varētu iekļūt dziļākos paraugos;
3) gara viļņa tuvējā infrasarkanā gaisma ir mazāk toksiska šūnām nekā īsa viļņa gaisma;
4) Izmantojot divu fotonu mikroskopu paraugu novērošanai, fotobalināšana un fototoksicitāte notiek tikai fokusa plaknē. Tāpēc divu fotonu mikroskopija ir piemērotāka nekā viena fotona mikroskopija biezu paraugu novērošanai, dzīvo šūnu novērošanai vai plankumu fotobalināšanas eksperimentiem.
Zināšanas par konfokālās fluorescences mikroskopiju
Konfokālās fluorescences mikroskopijas pamatprincips: parauga apstarošanai tiek izmantots punktveida gaismas avots, un fokusa plaknē veidojas labi definēts neliels gaismas plankums. sastāv no sadalītājiem. Staru sadalītājs nosūta fluorescenci tieši uz detektoru. Gaismas avota un detektora priekšā ir caurums, ko attiecīgi sauc par apgaismojuma caurumu un noteikšanas caurumu. Abu ģeometriskais izmērs ir vienāds, aptuveni 100-200nm; attiecībā pret gaismas plankumu fokusa plaknē abi ir konjugēti, tas ir, gaismas punkts iziet cauri virknei lēcu un, visbeidzot, vienlaikus var tikt fokusēts uz apgaismojuma adatas caurumu un noteikšanas adatas caurumu. Tādā veidā gaismu no fokusa plaknes var konverģēt noteikšanas cauruma ietvaros, savukārt izkliedētā gaisma no augšas vai zem fokusa plaknes tiek bloķēta ārpus noteikšanas cauruma un to nevar attēlot. Lāzers skenē paraugu punktu pa punktam, un fotopavairotāja caurule pēc cauruma noteikšanas iegūst arī atbilstošā gaismas punkta konfokālo attēlu punktu pa punktam, kas tiek pārveidots digitālā signālā un pārraidīts uz datoru, un visbeidzot tiek apkopots skaidrā formā. visas fokusa plaknes konfokālais attēls ekrānā.
Katrs fokusa plaknes attēls faktiski ir parauga optiskais šķērsgriezums. Šim optiskajam šķērsgriezumam vienmēr ir noteikts biezums, ko sauc arī par optisko plānu sekciju. Tā kā gaismas intensitāte fokusa punktā ir daudz lielāka nekā nefokusa punktā un nefokālās plaknes gaismu filtrē caurums, konfokālās sistēmas lauka dziļums ir aptuveni nulle, un skenēšana gar Z. -ass var realizēt optisko tomogrāfiju, veidojot Ievērojiet divdimensiju optisko sekciju parauga fokusētajā vietā. Apvienojot XY plaknes (fokālās plaknes) skenēšanu ar Z-ass (optiskās ass) skenēšanu, parauga trīsdimensiju attēlu var iegūt, akumulējot nepārtrauktu slāņu divdimensiju attēlus un apstrādājot ar speciālu datorprogrammu.
Tas nozīmē, ka noteikšanas caurums un gaismas avota caurums vienmēr ir fokusēti uz vienu un to pašu punktu, lai ārpus fokusa plaknes ierosinātā fluorescence nevarētu iekļūt noteikšanas caurumā.
Vienkāršā lāzera konfokālā darbības principa izpausme ir tāda, ka tas izmanto lāzeru kā gaismas avotu un, pamatojoties uz tradicionālo fluorescences mikroskopa attēlveidošanu, pievieno lāzerskenēšanas ierīci un konjugāta fokusēšanas ierīci, kā arī ir sistēma digitālo attēlu iegūšanai un apstrāde, izmantojot datora vadību.
