Tiešā mikroorganismu skaitīšana ar mikroskopu
Eksperimentālais princips
Tiešā skaitīšana mikroskopā, izmantojot hemocitometru, ir plaši izmantota mikrobu skaitīšanas metode. Šīs metodes priekšrocība ir tā, ka tā ir intuitīva un ātra. Ievietojiet atbilstoši atšķaidītu baktēriju suspensiju (vai sporu suspensiju) skaitīšanas kamerā starp priekšmetstikliņu un hemocitometra vāka stiklu un skaitiet zem mikroskopa. Tā kā skaitīšanas kameras tilpums ir fiksēts (0,1 mm2), to var pārvērst kopējā mikroorganismu skaitā tilpuma vienībā atbilstoši mikroskopā novēroto mikroorganismu skaitam. Tā kā šī metode saskaita dzīvo un mirušo baktēriju summu, to sauc arī par kopējo baktēriju skaitīšanas metodi.
Hemocitometrs parasti ir īpašs stikla priekšmetstiklis, uz kura četras rievas veido trīs platformas. Vidū platforma ir sadalīta divās daļās ar īsu horizontālu rievu. Uz platformas katrā pusē ir iegravēts režģis. Katrs režģis ir sadalīts deviņos lielos kvadrātos. Lielais laukums vidū ir skaitīšanas telpa. Mikroorganismu skaitīšana notiek skaitīšanas kamerā. Asins šūnu skaitīšanas paneļa struktūra ir parādīta Ⅷ-1 attēlā.
Skaitīšanas telpas mērogiem parasti ir divas specifikācijas, viena ir tāda, ka liels kvadrāts ir sadalīts 16 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 25 mazos kvadrātos (attēls Ⅷ-2); otrs ir liels laukums. Kvadrāts ir sadalīts 25 vidējos kvadrātos, un katrs vidējais kvadrāts ir sadalīts 16 mazos kvadrātos (attēls Ⅷ-1, C). Bet neatkarīgi no tā, kāda veida skaitīšanas dēlis tas ir, mazo kvadrātu skaits katrā lielajā kvadrātā ir vienāds, tas ir, 16 × 25=400 mazie kvadrāti, kā parādīts Ⅷ-2 attēlā.
Katra lielā kvadrāta malas garums ir 1 mm, un katra lielā kvadrāta laukums ir 1 mm2. Pēc vāka stikla aizsegšanas augstums starp bīdāmo stiklu un vāka stiklu ir 0,1 mm, tātad skaitīšanas kameras tilpums ir 0,1 mm3.
Skaitot, parasti saskaitiet kopējo baktēriju skaitu piecos vidējos režģī, pēc tam iegūstiet katra vidējā režģa vidējo vērtību un pēc tam reiziniet ar 16 vai 25, lai iegūtu kopējo baktēriju skaitu lielā režģī, un pēc tam konvertējiet uz kopējais baktēriju skaits 1 ml baktēriju šķīduma.
Laboratorijas aprīkojums
Hemocitometrs, mikroskops, segstikliņš, sterils kapilārs;
Eksperimentālie materiāli
Saccharomyces cerevisiae suspensija
Eksperimentālā procedūra (mikrobu mikroskopa tiešās skaitīšanas metode)
1. atšķaidīšana
Pareizi atšķaidiet Saccharomyces cerevisiae suspensiju. Ja baktēriju šķīdums nav biezs, tas nav jāatšķaida.
2. Mikroskopiskā skaitīšanas telpa
Pirms paraugu pievienošanas veiciet skaitīšanas plāksnes skaitīšanas kameras mikroskopisko pārbaudi. Ja ir netīrumi, pirms skaitīšanas tie ir jānotīra.
3. pievienot paraugu
Nosedziet tīru un sausu hemocitometra plāksni ar vāka stiklu un pēc tam izmantojiet sterilu, smalkas mutes pilinātāju, lai no vāka stikla malas pilinātu nelielu pilienu atšķaidīta Saccharomyces cerevisiae šķīduma (ne pārāk daudz), lai baktēriju šķīdums nonāktu. ir tuvu spraugai gar spraugu. Kapilārā osmoze pati iekļūst skaitīšanas kamerā, un vispārējo skaitīšanas kameru var piepildīt ar baktēriju šķidrumu. Uzmanieties, lai nebūtu gaisa burbuļu.
4. mikroskopa skaitīšana
Pēc 5 minūšu atpūtas novietojiet hemocitometru uz mikroskopa virsmas, vispirms izmantojiet mazjaudas objektīvu, lai atrastu skaitīšanas kameras atrašanās vietu, un pēc tam pārslēdzieties uz lielas jaudas objektīvu skaitīšanai. Ja pirms skaitīšanas tiek konstatēts, ka baktēriju šķīdums ir pārāk biezs vai pārāk plāns, pirms skaitīšanas ir nepieciešams atkārtoti pielāgot atšķaidījumu. Parasti parauga atšķaidīšanai katrā šūnā ir nepieciešamas aptuveni 5-10 baktērijas. Katra skaitīšanas kamera atlasa baktērijas 5 vidējos režģos (pēc izvēles 4 stūri un centrālie režģi) skaitīšanai. Baktērijas uz režģa līnijas parasti tiek skaitītas tikai augšējā un labajā līnijā. Rauga pumpuru veidošanās gadījumā, kad pumpuru ķermeņa izmērs sasniedz pusi no mātes šūnas, saskaitiet divas baktērijas. Saskaitiet paraugu, lai aprēķinātu baktēriju saturu paraugā no vērtībām, kas saskaitītas divās skaitīšanas kamerās.
5. Hemocitometra tīrīšana
Pēc lietošanas izskalojiet asins šūnu skaitīšanas plāksni uz jaucējkrāna ar ūdens strūklām, nemazgājiet to ar cietiem priekšmetiem un pēc mazgāšanas nosusiniet paši vai ar fēnu. Mikroskopiskā izmeklēšana, novērojiet, vai katrā šūnā nav atlikušas baktērijas vai citi nosēdumi. Ja tas nav tīrs, tas ir atkārtoti jāmazgā, līdz tas ir tīrs.
