Kā izvēlēties sev piemērotāko konfokālo mikroskopu? Vai ir kāda konkrēta metode?
Konfokālajai mikroskopijai ir vairāk priekšrocību nekā plaša lauka mikroskopijai. Konfokālā mikroskopija var veikt nepārtrauktu paraugu optisku sagriešanu un izslēgt signāla traucējumus no nefokālajām plaknēm. Šī iemesla dēļ konfokālās mikroskopijas pielietošana patiešām ir biežāka. Tomēr tirgū ir arvien vairāk konfokālo mikroskopu. Kā izvēlēties?
Konfokālajai mikroskopijai ir vairāk priekšrocību nekā plaša lauka mikroskopijai. Konfokālā mikroskopija var izveidot nepārtrauktas paraugu optiskās sekcijas un izslēgt signāla traucējumus no nefokālajām plaknēm. Šī iemesla dēļ konfokālā mikroskopija patiešām ir biežāka. Tomēr tirgū ir arvien vairāk konfokālo mikroskopu. Kā izvēlēties? Izvēloties konfokālo mikroskopu, ir jāņem vērā divi galvenie un svarīgi apsvērumi: parauga veids, kuru vēlaties pētīt (piemēram, fiksētas vai dzīvas šūnas), un testa veids, kuru vēlaties veikt (piemēram, statiski vai dinamiski šūnu procesi).
Fiksētu šūnu konfokālā attēlveidošana
Lai attēlotu fiksētas un iekrāsotas šūnas vai audus, mēs parasti izvēlamies konfokālo lāzerskenēšanas (LSCM). Tas ir galvenokārt tāpēc, ka fiksētajām mirušajām šūnām trūkst ātru bioloģisku notikumu dzīvās šūnās, un tās var labāk gūt labumu no LSCM augstākās telpiskās izšķirtspējas. LSCM attēlveidošana ir paredzēta parauga optiskai sagriešanai ar lāzeru, un skenēšanas ātrums (atkarībā no skenēšanas masīva spoguļa ātruma) parasti ir 1 kadrs sekundē. Garāks ekspozīcijas laiks nozīmē lielāku fotobalināšanas risku, taču fiksētām atmirušajām šūnām laiks nav kritisks, un mēs varam to aprēķināt, uzņemot vairākus attēlus.
Dzīvu šūnu konfokālā attēlveidošana
Dzīvu šūnu attēlveidošanai nepieciešama papildu aizsardzība pret nedraudzīgu vidi. Attēlveidošanas laikā mūsu pirmais apsvērums ir saglabāt šūnu dzīvotspēju un veselību. Pastāvīgas temperatūras sildelementi un perfūzijas sistēmas ir būtiskas, jo īpaši laika intervāla pētījumiem. Ātrie bioķīmiskie notikumi, kas kontrolē dzīvo šūnu fizioloģisko stāvokli, ir tas, ko lielākā daļa cilvēku vēlas pētīt, taču šie notikumi ir pārāk ātri parastajam LSCM. Turklāt ilgstoša LSCM iedarbība izraisīja arī toksiskus gaismas bojājumus šūnām. Tāpēc dzīvu šūnu attēlveidošanai nepieciešami īpaši konfokālie mikroskopi.
Parasti ir divas dzīvu šūnu konfokālās attēlveidošanas iespējas: ātras skenēšanas lāzerskenēšanas konfokālās un griežamās diska konfokālās attēlveidošanas iespējas. Ātri skenējošā konfokālā mikroskopija aizvieto lēnākus galvanometru spoguļus ar ātrākiem rezonanses skenēšanas spoguļiem, nodrošinot skenēšanas ātrumu līdz 30 kadriem sekundē; lai gan griežamo disku konfokālo disku (SDCM) priekšrocība ir ātrāka skenēšana (lai gan neizbēgami tiek zaudēta telpiskā izšķirtspēja), tā ātrums teorētiski var sasniegt 2000 kadrus sekundē (praksē to bieži ierobežo citi faktori).
Ja jūs uztrauc fotobalināšana vai ļoti vājš fluorescences signāls, SDCM var būt piemērotāks. SDCM izmanto divus rotējošus diskus ar sakārtotām mikrodobēm, lai izkliedētu ierosmes gaismu. Atšķirībā no LSCM, kas skenē parauga vietu, SDCM iegūst vairākus plankumus vienlaikus (apmēram 100 pikseļu plankumi), tāpēc ātrums ir ievērojami palielināts un SDCM fotobalināšana un mazāka fototoksicitāte. Tomēr varat arī izmantot ātrās skenēšanas konfokālos instrumentus, lai palielinātu skenēšanas ātrumu, apvienojumā ar ļoti jutīgiem detektoriem un samazinātu ierosmes gaismas enerģiju, lai samazinātu fototoksicitāti, kas var saglabāt tradicionālo konfokālo ierīču bagātīgās funkcijas.
Automatizēta konfokālā attēlveidošanas sistēma
Dažiem pētniekiem patīk atrast veidus, kā modificēt mikroskopu, lai tas atbilstu viņu individuālajām vajadzībām. Un dažus pētniekus pat neinteresē, kā patiesībā darbojas mikroskopi. Pēdējiem automātiskais konfokālais mikroskops viņiem var vairāk patikt. Piemēram, Olympus FluoViewFV10i ir pilnībā automātisks darbvirsmas 4-konfokālais lāzera mikroskops. Tā kompaktajai integrētajai konstrukcijai gandrīz nav nepieciešama uzstādīšanas vieta. Šāda veida instrumenti ir ideāli piemēroti pētniekiem, kuriem katru dienu ir jāveic daudz attēlu datu iegūšanas, taču, protams, tie pilnībā neatspoguļo tradicionālo konfokālu funkcionalitāti un elastību. Turklāt NikonA1 ir arī pilnībā automātiska konfokālā sistēma. Tāpat kā vairums parasto konfokālās skenēšanas mikroskopu, NikonA1 izmanto galvanometra skenēšanas galviņu, kurai ir augstāka izšķirtspēja nekā A1R ar hibrīda skenēšanas galviņu, bet nedaudz lēnāks ātrums (A1R ~ 30 kadri/s).
