Kā fluorescences mikroskopija atšķiras no parastās mikroskopijas
Es nesen mēģināju izveidot dažas sasaldētas peļu daļas, un tagad man ir jāizmanto fluorescences mikroskops, lai redzētu, vai vīruss, ko es injicēju, atrodas vēlamajā smadzeņu zonā. Ir īsi jāizpēta daži fluorescences mikroskopijas pamatprincipi, un es ar tiem arī dalīšos šeit.
Fluorescences mikroskops izmanto ultravioleto gaismu kā gaismas avotu, lai apgaismotu pārbaudāmo objektu, liekot objektam izstarot gaismas avotu un pēc tam novērot objektu zem mikroskopa. Galvenokārt izmanto imunofluorescences šūnām, tas sastāv no gaismas avota, filtru plākšņu sistēmas un optiskās sistēmas, lai novērotu parauga fluorescences attēlu, palielinot okulāru un objektīvu. Apskatīsim atšķirību starp šo fluorescences mikroskopu un parasto optisko mikroskopu.
1. Runājot par apgaismojuma metodēm
Fluorescences mikroskopa apgaismojuma metode parasti izmanto krītošā stara metodi, kas nozīmē, ka gaismas avots tiek projicēts uz testa paraugu caur objektīvu.
2. Izšķirtspējas ziņā
Fluorescences mikroskopijā kā gaismas avots tiek izmantota ultravioletā gaisma ar salīdzinoši īsu viļņa garumu, bet augstāku izšķirtspēju nekā parastajiem optiskajiem mikroskopiem.
3. Filtra atšķirības
Fluorescences mikroskopā tiek izmantoti divi īpaši filtri, viens atrodas gaismas avota priekšā, lai filtrētu redzamo gaismu, bet otrs starp objektīvu un okulāru, lai filtrētu ultravioleto gaismu, kas var aizsargāt acis.
Fluorescences mikroskopija ir arī optiskā mikroskopa veids, galvenokārt tāpēc, ka fluorescences mikroskopijas ierosinātais viļņa garums ir īss, kas izraisa atšķirības fluorescences mikroskopijas un parastās mikroskopijas struktūrā un lietojumā. Lielākajai daļai fluorescences mikroskopu ir laba funkcija vājas gaismas uztveršanai, tāpēc to attēlveidošanas spēja ir laba arī ļoti vājas fluorescences apstākļos. Turklāt, pēdējos gados nepārtraukti uzlabojot fluorescences mikroskopiju, arī troksnis ir ievērojami samazināts. Tāpēc arvien vairāk tiek pielietoti fluorescences mikroskopi.
Zināšanas, kas saistītas ar divu fotonu fluorescences mikroskopiju
Divu fotonu ierosmes pamatprincips ir tāds, ka pie augsta fotonu blīvuma fluorescējošās molekulas var vienlaicīgi absorbēt divus gara viļņa garuma fotonus un pēc īsa tā sauktā ierosinātā stāvokļa dzīves perioda izstarot īsāka viļņa garuma fotonu; Tā iedarbība ir tāda pati kā fotona izmantošana ar viļņa garumu, kas ir puse no garā viļņa garuma, lai ierosinātu fluorescējošas molekulas. Divu fotonu ierosināšanai nepieciešams augsts fotonu blīvums, un, lai nesabojātu šūnas, divu fotonu mikroskopā tiek izmantots augstas enerģijas režīmā bloķēts impulsu lāzers. Šāda veida lāzera izstarotajam lāzeram ir augsta maksimālā enerģija un zema vidējā enerģija, ar impulsa platumu tikai 100 femtosekundes un frekvenci līdz 80 līdz 100 megaherciem. Izmantojot augstas skaitliskās apertūras objektīvu, lai fokusētu impulsa lāzera fotonus, fotonu blīvums objektīva fokusa punktā ir visaugstākais, un divu fotonu ierosme notiek tikai objektīva fokusa punktā. Tāpēc divu fotonu mikroskopam nav nepieciešami konfokāli caurumi, kas uzlabo fluorescences noteikšanas efektivitāti.
Vispārējās fluorescences parādībās ierosmes zemā fotonu blīvuma dēļ fluorescējoša molekula var vienlaikus absorbēt tikai vienu fotonu un pēc tam izstarot vienu fluorescējošu fotonu caur starojuma pāreju, ko sauc par viena fotona fluorescenci. Fluorescences ierosmes procesā, izmantojot lāzeru kā gaismas avotu, var rasties divu fotonu vai pat daudzfotonu fluorescences parādības. Šobrīd izmantotajam ierosmes gaismas avotam ir augsta intensitāte, un fotonu blīvums atbilst fluorescējošām molekulām, kas vienlaikus absorbē divus fotonus. Izmantojot tipisku lāzeru kā ierosmes gaismas avotu, fotonu blīvums joprojām nav pietiekams, lai radītu divu fotonu absorbcijas fenomenu. Parasti tiek izmantoti femtosekundes impulsu lāzeri, un to momentānā jauda var sasniegt megavatu līmeni. Tāpēc divu fotonu fluorescences viļņa garums ir īsāks nekā ierosmes viļņa garums, kas ir līdzvērtīgs efektam, ko rada ierosmes uz pusi ierosmes viļņa garums.
