Ievads fluorescences mikroskopijā
Fluorescences mikroskopijas mērķis ir apstarot ar fluoresceīnu iekrāsoto objektu ar īsa viļņa garuma gaismu, lai tas tiktu ierosināts, radot gara viļņa garuma fluorescenci, un pēc tam novērots. Fluorescences mikroskopā no parauga apgaismojuma gaismas ir jāizvēlas noteikta viļņa garuma ierosmes gaisma, lai radītu fluorescenci, un pēc tam fluorescence ir jāatdala no ierosmes gaismas un fluorescences jauktās gaismas novērošanai. Tāpēc filtra sistēmai ir ārkārtīgi svarīga loma konkrēta viļņa garuma izvēlē. Fluorescences mikroskopus plaši izmanto bioloģijā, medicīnā un citās jomās.
1. Fluorescences mikroskopa galvenās sastāvdaļas:
(A) Gaismas avots: gaismas avots izstaro dažāda viļņa garuma gaismu (no ultravioletā līdz infrasarkanajam). uz
(B) ierosmes filtra gaismas avots: caur noteikta viļņa garuma gaismu, kas var izraisīt parauga fluorescenci, vienlaikus bloķējot gaismu, kas nav noderīga ierosinošai fluorescencei. uz
(C) Fluorescējoši paraugi: parasti iekrāso ar fluorescējošiem pigmentiem. uz
(D) Bloķējošs filtrs: bloķējiet ierosmes gaismu, ko paraugs neabsorbē, un selektīvi pārraida fluorescenci, un daži viļņu garumi tiek selektīvi pārraidīti fluorescencē.
uz
2. Fluorescences mikroskopu klasifikācija:
Fluorescences mikroskopus parasti iedala divos veidos: transmisijas un epi-emisijas:
a. Raidīšanas veids: ierosmes gaisma nāk no pārbaudāmā objekta apakšas, un kondensators ir tumšā lauka kondensators, lai ierosmes gaisma neietilpst objektīva objektīvā, bet fluorescence nonāk objektīva lēcā. Mazā palielinājumā tas ir gaišs, bet lielā palielinājumā – tumšs. Ir grūti darboties eļļas iegremdēšanas un centrēšanas režīmā. Īpaši grūti ir noteikt apgaismojuma diapazonu pie neliela palielinājuma, taču tas var iegūt ļoti tumšu redzes lauka fonu. Pārraides veids netiek izmantots necaurspīdīgiem objektiem. uz
b. Epi-type: transmisijas veids pašlaik ir gandrīz likvidēts. Lielākā daļa jauno fluorescences mikroskopu ir epi tipa mikroskopi. Gaismas avots nāk no pārbaudāmā objekta augšpuses, un optiskajā ceļā ir staru sadalītājs, tāpēc tas ir piemērots gan caurspīdīgiem, gan necaurspīdīgiem pārbaudāmiem objektiem. Tā kā objektīvs darbojas kā kondensatora objektīvs, tas ir ne tikai viegli lietojams, bet arī var nodrošināt vienmērīgu visa redzes lauka apgaismojumu no maza palielinājuma līdz lielam palielinājumam. uz
uz
3. Piesardzības pasākumi fluoroskopijai
a. Ilgstoša ierosmes gaismas apstarošana izraisīs fluorescences vājināšanos un dzēšanu, tāpēc pēc iespējas saīsiniet novērošanas laiku un izmantojiet deflektoru, lai aizsegtu ierosmes gaismu, kad īslaicīgi nenovēro. uz
b. Novērojot ar eļļas imersijas objektīvu, izmantojiet "nefluorescējošu eļļu". uz
c. Fluorescence gandrīz vienmēr ir vāja, un tā jāveic tumšā telpā. uz
d. Vislabāk ir uzstādīt barošanas blokā sprieguma stabilizatoru, pretējā gadījumā nestabilais spriegums ne tikai samazinās dzīvsudraba lampas kalpošanas laiku, bet arī ietekmēs mikroskopa pārbaudes efektu. uz
uz
4. Fluorescences mikroskopijas izmantošana
1. Sagatavošanas prasības fluorescences mikroskopa paraugiem
a. Stikla slidkalniņš
Stikla priekšmetstikliņa biezumam jābūt no 0,8 līdz 1,2 mm. Pārāk biezs priekšmetstiklis absorbēs vairāk gaismas, no vienas puses, un, no otras puses, ierosmes gaismu nevar koncentrēt uz parauga. Priekšmetstikliņiem jābūt gludiem, vienāda biezuma un bez acīmredzamas autofluorescences. Dažreiz tiek izmantoti kvarca stikla priekšmetstikliņi. uz
b. Pārklājošais stikls
Pārsega stikla biezums ir aptuveni 0,17 mm, gluds. Lai stiprinātu ierosmes gaismu, var izmantot arī sausu pārklājuma stiklu, kas ir speciāls pārklājuma stikls, kas pārklāts ar vairākiem vielu slāņiem (piemēram, magnija fluorīdu), kam ir dažāda traucējumu ietekme uz dažāda viļņa garuma gaismu, kas var radīt fluorescence norit gludi. Caur tiek izlaista ierosmes gaisma, un atstarotā ierosmes gaisma ierosina paraugu. uz
c. Eksemplārs
Audu šķēles vai citi paraugi nedrīkst būt pārāk biezi. Ja tas ir pārāk biezs, lielākā daļa ierosmes gaismas tiks patērēta parauga apakšējā daļā, savukārt augšējo daļu, ko tieši novēro objektīva lēca, nevar pilnībā ierosināt. Turklāt šūnu pārklāšanās vai piemaisījumi aizsedz, ietekmējot spriedumu. uz
d. Montāžas līdzeklis
Glicerīnu parasti izmanto kā stiprinājuma līdzekli, kam nedrīkst būt autofluorescences, tas ir bezkrāsains un caurspīdīgs, un fluorescences spilgtums ir spilgtāks pie pH 8.{1}}.5, un tas nav viegli ātri izbalināt. Tāpēc kā stiprinājuma līdzekli parasti izmanto vienādu glicerīna un 0,5 mol/l karbonāta buferšķīduma maisījumu ar pH no 9.0 līdz 9,5. uz
e. spoguļu eļļa
Parasti, novērojot paraugus ar tumšā lauka fluorescences mikroskopiem un eļļas imersijas objektīviem, ir jāizmanto imersijas eļļa. Vislabāk ir izmantot speciālu nefluorescējošu spoguļeļļu, kuru var aizstāt arī ar iepriekš minēto glicerīnu, kā arī var izmantot šķidro parafīnu, taču refrakcijas indekss ir zems, kas nedaudz ietekmē attēla kvalitāti.
