Zināšanas par divu{0}}fotonu fluorescences mikroskopiju
Divu{0}}fotonu ierosmes pamatprincips ir tāds, ka pie augsta fotonu blīvuma fluorescējošās molekulas var vienlaikus absorbēt divus gara viļņa garuma fotonus un pēc īsa -ts ierosinātā stāvokļa kalpošanas laika izstarot īsāka viļņa garuma fotonu; Efekts ir tāds pats kā izmantojot fotonu ar pusi no garā viļņa garuma, lai ierosinātu fluorescējošas molekulas. Divu fotonu ierosināšanai nepieciešams augsts fotonu blīvums, un, lai izvairītos no šūnu bojājumiem, divu-fotonu mikroskopijā tiek izmantoti augstas-enerģijas režīma{5}}bloķētie impulsu lāzeri. Šī lāzera izstarotajam lāzeram ir augsta maksimālā enerģija un zema vidējā enerģija ar impulsa platumu tikai 100 femtosekundes un frekvenci līdz 80 līdz 100 megaherciem. Izmantojot lielas skaitliskās apertūras objektīvu, lai fokusētu impulsa lāzera fotonus, fotonu blīvums objektīva fokusa punktā ir visaugstākais, un divu fotonu ierosme notiek tikai objektīva lēcas fokusa punktā. Tāpēc divu{13}}fotonu mikroskopam nav nepieciešams konfokālais caurums, kas uzlabo fluorescences noteikšanas efektivitāti.
Vispārējās fluorescences parādībās ierosmes gaismas zemā fotonu blīvuma dēļ fluorescējoša molekula var vienlaikus absorbēt tikai vienu fotonu un pēc tam izstarot citu fluorescējošu fotonu, izmantojot starojuma pāreju, ko sauc par viena fotona fluorescenci. Fluorescences ierosmes procesos, izmantojot lāzerus kā gaismas avotus, var rasties divu fotonu vai pat daudzfotonu fluorescences parādības. Šajā gadījumā izmantotajam ierosmes gaismas avotam ir augsta intensitāte un fotonu blīvums, kas atbilst fluorescējošām molekulām, kas vienlaikus absorbē divus fotonus. Izmantojot vispārējo lāzeru kā ierosmes gaismas avotu, fotonu blīvums joprojām ir nepietiekams, lai radītu divu fotonu absorbcijas fenomenu. Parasti tiek izmantoti femtosekundes impulsu lāzeri, kuru momentānā jauda sasniedz megavatu līmeni. Tāpēc divu-fotonu fluorescences viļņa garums ir īsāks nekā ierosmes gaismas viļņa garums, kas ir līdzvērtīgs efektam, ko rada ierosmes puse uz viļņa garuma.
