Zemu izmaksu fluorescence un spilgta lauka mikroskopa dizains
Šajā rokasgrāmatā es apskatīšu fluorescences mikroskopijas pamatprincipus un to, kā izveidot trīs dažādus zemu izmaksu fluorescences mikroskopus. Šīs sistēmas parasti maksā tūkstošiem dolāru, taču nesenie centieni ir padarījuši tās vieglāk pieejamas. Dizains, ko es šeit ieviešu, izmanto viedtālruņus, dSLR un USB mikroskopus. Visas šīs konstrukcijas var izmantot arī kā atklātā lauka mikroskopus.
1. darbība: fluorescences mikroskopijas pārskats
Lai saprastu fluorescences mikroskopijas pamatjēdzienus, iedomājieties blīvos mežus, kokus, dzīvniekus, krūmus un citus mežus, kas dzīvo mežā naktī. Ja jūs mežā apgaismosiet lukturīti, jūs redzēsiet visas šīs struktūras un ir grūti iedomāties konkrētus dzīvniekus vai augus. Pieņemot, ka jūs interesē tikai redzēt melleņu krūmus mežā. Lai to panāktu, jātrenē ugunspuķes, lai tās piesaistītu tikai melleņu krūmi, lai, skatoties uz mežu, iedegtos tikai melleņu krūmi. Var teikt, ka melleņu krūmus iezīmējāt ar ugunskuriem, tātad var redzēt melleņu struktūras mežā.
Šajā analoģijā mežs attēlo visu paraugu, melleņu krūms apzīmē struktūru, kuru vēlaties vizualizēt (piemēram, konkrētas šūnas vai subcelulāras organellas), un ugunspuķes ir fluorescējoši savienojumi. Situācija, fotografējot ar lukturīti vienatnē bez ugunskuriem, ir līdzīga spilgta lauka mikroskopam.
Nākamais solis ir izprast fluorescējošo savienojumu (pazīstami arī kā fluorofori) pamatfunkcijas. Fluorescējošie klasteri faktiski ir mazi objekti (nanomēroga), kas paredzēti, lai savienotu konkrētas struktūras paraugā. Tie absorbē gaismu ar šauru viļņu garumu diapazonu un atkārtoti izstaro cita viļņa garuma gaismu. Piemēram, fluorescējoša grupa var absorbēt zilo gaismu (ti, fluorescējošā grupa tiek ierosināta ar zilu gaismu) un pēc tam atkal izstarot zaļo gaismu. Parasti to apkopo ierosmes un emisijas spektros (kā parādīts attēlā iepriekš). Šīs diagrammas parāda fluorofora absorbētās gaismas viļņu garumus un fluorofora izstarotās gaismas viļņu garumus.
Mikroskopa dizains ir ļoti līdzīgs parasta atklāta lauka mikroskopa konstrukcijai ar divām galvenajām atšķirībām. Pirmkārt, gaismai, kas apgaismo paraugu, jābūt ierosinātās fluorescējošās grupas viļņa garumā (iepriekš minētajā piemērā gaisma ir zila). Otrkārt, mikroskopam ir jāsavāc tikai izstarotā gaisma (zaļā gaisma), vienlaikus bloķējot zilo gaismu. Tas ir tāpēc, ka zilā gaisma ir visur, bet zaļā gaisma nāk tikai no konkrētām parauga struktūrām. Lai bloķētu zilo gaismu, mikroskopiem parasti ir kaut kas, ko sauc par garās caurlaidības filtru, kas ļauj zaļajai gaismai iziet cauri bez zilas gaismas. Katram garās caurlaidības filtram ir ierobežots viļņa garums. Ja gaismas viļņa garums ir lielāks par robežviļņa garumu, tas var iziet cauri filtram. Tāpēc nosaukums ir "Long Distance Pass". Īsāki viļņu garumi ir bloķēti.
2. darbība: mikroskopa modelēšana, izmantojot optisko optiku
Šis ir papildu solis mikroskopa pamatprincipa izstrādē. Nav nepieciešams veidot fluorescences mikroskopu, tāpēc, ja nevēlaties iedziļināties optikā, varat to izlaist.
Gan spilgtā lauka, gan fluorescences mikroskopus var modelēt, izmantojot staru optiskās ierīces. Staru optikas pamatprincips ir tāds, ka gaismas uzvedība ir līdzīga gaismai, kas izplatās prom no gaismas avota. Aplūkojot istabu, jūs redzēsiet saules gaismu aiz loga vai spuldzes atnesto gaismu. Tad gaismu absorbē vai atstaro telpā esošie objekti. Nedaudz atstarotās gaismas liks tai saskarties ar jūsu acīm. Ja objekts ir apgaismots, varat iedomāties, ka katrs objekta punkts izstaro gaismu visos virzienos (kā parādīts iepriekš attēlā). Lēca, tāpat kā lēca mūsu acīs, fokusē gaismu uz punktu, lai mēs varētu redzēt objektu. Bez objektīva gaisma turpina izplatīties uz āru un neveido attēlu.
