Daudzfotonu mikroskopu fokusa dziļuma palielināšanas metodes
Divu{0}}fotonu lāzera skenēšanas mikroskopa un kalcija indikatora kombinācija ir zelta standarts in vivo neironu signālu noteikšanai. Neironu tīklu neironi ir sadalīti trīsdimensiju telpā, un, lai uzraudzītu to aktivitātes dinamiku, ir nepieciešams veids, kā ātri uzlabot apjoma attēlveidošanas ātrumu. Tomēr, izmantojot režģa skenēšanas daudzfotonu mikroskopu, lai attēlotu lielu attēlu skaitu, ja tiek izmantots augstas skaitliskās apertūras (NA) objektīvs, lai panāktu lielāku sānu izšķirtspēju, tas radīs mazāku fokusa dziļumu. Lai iegūtu apjoma attēlveidošanu nelielā fokusa dziļumā,
Ir nepieciešams veikt Z-ass skenēšanu, izmantojot dažus līdzekļus, attēlojot daudzas plaknes, skenējot katru fokusa plakni, kas ievērojami ierobežo attēlveidošanas ātrumu. Ja aksiālo attēla informāciju var upurēt un apjoma skenēšanu var panākt vienā sānu skenēšanā, paplašinot fokusa dziļumu, tas ir, apjoma informācija tiek projicēta vienā 2D attēlā, attēlveidošanas ātrumu var ievērojami uzlabot. To sauc par paplašinātā fokusa dziļuma (EDF) attēlveidošanu, kas ir īpaši noderīga, lai attēlotu retas populācijas struktūras, kurām nepieciešama augsta laika izšķirtspēja, piemēram, neironu aktivitātes funkcionālā attēlveidošana.
Mikroskopa aksiālo un sānu izšķirtspēju nosaka objektīva objektīva skaitliskā apertūra (NA). Augsta NA var palielināt aksiālo un sānu izšķirtspēju, kā arī savāktās gaismas daudzumu; Zemāka NA radīs zemāku aksiālo izšķirtspēju, ti, lielāku fokusa dziļumu, bet tajā pašā laikā upurēs sānu izšķirtspēju un gaismas savākšanas efektivitāti. Ar fokusa dziļuma paplašināšanas metodi, kas tiks ieviesta nākamajā, to var panākt, vienlaikus saglabājot augstu sānu izšķirtspēju un pietiekamu gaismas plūsmu.
Telpisko gaismas modulatoru izmantošana fokusa slaidu Besela staru ģenerēšanai var nodrošināt EDF attēlveidošanu, taču telpiskie gaismas modulatori ir apjomīgi un grūti savietojami ar šaurām mikroskopa telpām; Turpretim Besela moduļi, kuru pamatā ir aksiālās piramīdas, ir lēti un kompakti, taču tie spēj ģenerēt tikai fiksēta dziļuma fokusa punktus un nav piemēroti dažādiem eksperimentiem, kuros nepieciešamas nepārtrauktas fokusa dziļuma izmaiņas. Lai risinātu šo problēmu, 2018. gadā RONGWEN LU u.c. demonstrēja Besela moduli, kura pamatā ir aksikons, kurā tikai viens objektīvs ir jāpārvērš pa optisko asi, lai nepārtraukti pielāgotu Besela fokusa punkta aksiālo garumu.
1. attēls a) Besela moduļa ierīces diagramma; (b) Punktu izkliedes funkcija tika eksperimentāli izmērīta, kad D bija attiecīgi -12 mm, 0 mm un 12 mm; (c) Attiecība starp sānu pilno platumu līdz pusei maksimuma, (d) aksiālo pilno platumu līdz pusei maksimuma, (e) maksimālo signālu un (f) optisko jaudu aiz objektīva ar L2 nobīdi D
Moduļu ierīce mainīga garuma Besela fokusa punkta veidošanai ir parādīta 1.a attēlā. Krītošais Gausa stars tiek veidots apļveida starā pēc tam, kad tas iziet cauri asikonam un objektīvam L1. Sekojošā apļveida diafragmas atvēruma maska var bloķēt izkliedēto gaismu, ko izraisa aksikona defekti, tādējādi veidojot divu -fotonu ierosmes punktu izplatības funkcijas aksiālo sadalījumu. Pēc tam gaismas stars tiek projicēts uz galvanometru ar lēcām L2 un L3, un pēc tam caur lēcām L4 un L5 sasniedz objektīva aizmugurējo fokusa plakni.
Šie dizaini ir līdzīgi tradicionālajiem piramīdas moduļiem, ar atšķirību, ka, pārvietojot L2 vai L3 pa optisko asi, Besela fokusa aksiālo garumu var nepārtraukti pielāgot. 1.b attēlā parādītas aksiālā punkta izkliedes funkcijas D vērtībām -12 mm, 0 mm un 12 mm, ar aksiālo pilno platumu pie 39? m,24? M un 14? m. Kā parādīts 1.c-f attēlā, objektīva L2 pārvietošana no kreisās puses uz labo pusi var nepārtraukti mainīt pilnu platumu uz pusi maksimuma gan šķērsvirzienā, gan aksiālā virzienā, kas nozīmē, ka fokusa dziļumu var nepārtraukti mainīt. Skaitliskās simulācijas rezultāti, kas balstīti uz vektoru difrakcijas teoriju, labi saskan ar eksperimentālajiem datiem. 2. attēlā ir pārbaudīta dažāda izmēra gredzenveida masku korekcijas ietekme uz aksikona defektiem. Ir konstatēts, ka plānākas gredzenveida maskas var labāk optimizēt izejas Besela staru kūļa aksiālās intensitātes sadalījumu, bet tajā pašā laikā tās arī rada lielāku jaudas zudumu.
