Mikroskopiskās attēlveidošanas klase丨Fluorescences mikroskopijas pielietošana
Kopējās iekšējās atstarošanas fluorescences mikroskopija (TIRFM) ir metode, kas izmanto izgaistošu vilni, ko rada gaismas stars, kas izplatās starp divām dažādām refrakcijas indeksa vidēm, lai pārbaudītu fluorescējoši iezīmētu dzīvo šūnu virsmu. Praksē, kad krītošs lāzera stars saskaras ar saskarni starp segstikliņu un ūdens vidi, kurā ir šūnas, tas tiek atspoguļots kritiskajā leņķī (kopējā iekšējā atstarošana). Tā kā izgaistošā viļņa enerģija eksponenciāli samazinās līdz ar attālumu no pārklājuma, izgaismojošais vilnis ierosina tikai fluoroforus, kas atrodas 10 nanometru attālumā no virsmas (no 10 līdz 200 nanometriem), savukārt tālāk esošie fluorofori lielākoties nav ierosināti. Ietekmētais. Tādējādi TIRFM rada augstus signāla līmeņus no fluoroforiem, kas atrodas netālu no pārklājuma, kas atrodas uz ļoti tumša fona, nodrošinot lielisku signāla un trokšņa attiecību. Ekstrēms ierosmes dziļuma ierobežojums ir ideāls, lai pētītu atsevišķas molekulas vai membrānu un organellu sastāvu pielipušajās šūnās pie pārklājuma virsmas (sk. 8. attēlu (e)). Tā kā ierosināšana attiecas tikai uz plāniem reģioniem, kas atrodas tuvu pārklājumam, fotobalināšana un fototoksicitāte attiecas arī uz šiem reģioniem, padarot TIRFM par vienu no visnoderīgākajām metodēm ilgstošai novērošanai. Šī metode ir kļuvusi par fundamentālu instrumentu, lai pētītu plašu parādību klāstu šūnu un molekulārajā bioloģijā.
Dekonvolūcija ir algoritms, ko izmanto visu fokusu attēlu kopai, kas iegūta gar optisko (Z) asi, lai uzlabotu fotonu signālu attēlu kaudzē konkrētai attēla plaknei vai vairākām fokusa plaknēm. Mikroskopiem jābūt aprīkotiem ar augstas precizitātes motorizētiem fokusa piedziņām, lai garantētu attēla iegūšanu precīzi noteiktos intervālos starp parauga fokusa plaknēm. Tipiskā pielietojumā (sk. 8. att. (f)) dekonvolūcijas process tiek izmantots, lai izpludinātu un noņemtu ārpusfokusa gaismu no noteiktā fokusa plaknes, izmantojot plaša lauka fluorescences ierosmi un emisiju. Sarežģītākā lietojumprogramma ir dekonvolūcijas procesa pielietošana visai attēlu kopai, lai ģenerētu projicētos skatus vai 3D modeļus. Plaša lauka attēlu kopums, ko izmanto dekonvolūcijai, fiksē teorētiski maksimālo parauga emitēto fotonu skaitu. Dekonvolūcijas process pārdala fotonu "izplūdušo" intensitāti, kas izstaro virs un zem fokusa plaknes, atpakaļ uz sākotnējo plakni. Tādējādi dekonvolūcija izmanto gandrīz visas pieejamās emisijas intensitātes un nodrošina optimālu gaismas budžetu, padarot šo metodi par izvēles metodi ļoti gaismas jutīgiem paraugiem.
Rezonanses enerģijas pārneses fenomena variants uz fluorescences mikroskopijas, fluorescences vai Förster rezonanses enerģijas pārneses (FRET) tiek izmantots, lai iegūtu kvantitatīvu laika un telpisko informāciju par proteīnu, lipīdu, enzīmu un nukleīnskābju saistīšanos un mijiedarbību dzīvās šūnās. FRET var izmantot konstanta stāvokļa vai laika izšķirtspējas metodes, bet laika izšķirtspējas FRET attēlveidošanas priekšrocība ir precīzāka donora un akceptora attāluma kartēšana. FRET attēlveidošanai var izmantot standarta plata lauka fluorescences mikroskopu, kas aprīkots ar atbilstošiem ierosmes un emisijas filtriem un jutīgu kameru. Pašlaik šūnu bioloģijā plaši izmanto biosensorus, kas izvieto videi jutīgu proteīnu vai peptīdu starp diviem FRET piemērojamiem fluorescējošiem proteīniem. Šīs zondes var viegli attēlot plaša lauka fluorescences mikroskopijā, izmantojot sensibilizētās emisijas FRET metodes apvienojumā ar ratiometrisko analīzi. Turklāt spektrālā attēlveidošana un lineārā atjaukšana, izmantojot lāzera skenēšanas konfokālo mikroskopiju, var palīdzēt uzraudzīt FRET parādības biosensoros un citos fluorescējošu proteīnu lietojumos.
Fluorescences mūža attēlveidošanas mikroskopija (FLIM) ir sarežģīta metode, kas spēj vienlaicīgi reģistrēt fluorescences kalpošanas laiku un fluorofora telpisko atrašanās vietu katrā attēla vietā. Šī metode nodrošina mehānismu, lai pētītu vides parametrus, piemēram, pH, jonu koncentrāciju, šķīdinātāja polaritāti, nekovalento mijiedarbību, viskozitāti un skābekļa spriegumu atsevišķās dzīvās šūnās, un sniedz datus telpiskos un laika blokos. Ierosināto stāvokļu kalpošanas laika FLIM mērījumi nanosekunžu skalā nav atkarīgi no vietējās fluoroforu koncentrācijas, fotobalināšanas efektiem un ceļa garuma (parauga biezuma), bet ir jutīgi pret ierosinātā stāvokļa reakcijām, piemēram, rezonanses enerģijas pārnesi. Faktiski FLIM apvienošana ar FRET, uzraugot fluorescējošu donoru dzīves izmaiņas pirms un pēc rezonanses enerģijas pārneses, tiek uzskatīta par vienu no labākajiem veidiem, kā izpētīt šo fenomenu.
Fluorescenti iezīmētu makromolekulu un mazu fluoroforu mobilitāti (šķērsvirziena difūzijas koeficientu) var noteikt ar fluorescences atjaunošanu pēc fotobalināšanas (FRAP) tehnikas. FRAP ļoti mazs izvēlēts laukums (dažu mikrometru diametrā) tiek intensīvi apgaismots, parasti ar lāzeru, lai šajā apgabalā pilnībā izbalinātu fluoroforu. Rezultāts ir dramatiska fluorescences samazināšanās vai iznīcināšana. Pēc fotobalināšanas impulsa fluorescences intensitātes atjaunošanās ātrums un apjoms balinātajos reģionos tika uzraudzīts kā laika funkcija pie zemas ierosmes intensitātes, lai iegūtu informāciju par fluoroforu repopulācijas un atjaunošanās kinētiku (9. attēls). FRAP parasti veic, izmantojot EGFP vai citus fluorescējošus proteīnus. Saistītās fotoaktivācijas metodes ir balstītas uz īpašiem sintētiskiem sprostos fluoroforiem vai līdzīgi funkcionāliem fluorescējošiem proteīniem, kurus var aktivizēt ar īsiem UV vai violetas impulsiem. Fotoaktivāciju un FRAP var izmantot kā papildu metodes mobilitātes parametru noteikšanai.
Ar FRAP saistītā tehnikā, ko sauc par fluorescences zudumu pēc fotobalināšanas (FLIP), noteikts fluorescējošs reģions dzīvā šūnā tiek pakļauts atkārtotai fotobalināšanai ar intensīvu apstarošanu. Ja visi fluorofori izmērītajā laika periodā spētu izkliedēties fotobalinātajā zonā, tas izraisītu pilnīgu fluorescējošā signāla zudumu visā šūnā. Aprēķinot ātrumu, kādā fluorescence pazūd no visas šūnas, var noteikt mērķa fluorofora difūzijas mobilitāti. Turklāt FLIP var viegli noteikt jebkuru difūzijas barjeru atrašanās vietu un raksturu starp atsevišķiem šūnu nodalījumiem, piemēram, barjeru starp neirona somu un aksonu.
Fluorescences korelācijas spektroskopija (FCS), ko galvenokārt izmanto lāzerskenēšanas konfokālajā mikroskopijā vai daudzfotonu mikroskopijā, ir metode, kas izstrādāta, lai noteiktu kinētisko informāciju, piemēram, ķīmiskās reakcijas ātrumu, difūzijas koeficientus, molekulmasas, plūsmas ātruma un agregācijas metodes. FCS mazs tilpums (apmēram viens femtometrs; difrakcijas ierobežotais lāzera fokuss) tiek izgaismots ar fokusētu lāzera staru, lai reģistrētu fluorescējošu molekulu dinamikas izraisītās autofluorescences intensitātes svārstības kā laika funkciju fluorescējošās spuldzes aizņemtajā tilpumā. molekulas (10. att.). Salīdzinoši mazi fluorofori ātri izkliedējas apgaismotajā tilpumā, radot īsus nejaušas intensitātes uzliesmojumus. Un otrādi, lielāki kompleksi (fluorofori, kas saistīti ar makromolekulām) pārvietojas lēnāk, radot garākus, noturīgākus no laika atkarīgus fluorescences intensitātes modeļus.
Ja fluorescējoši marķētas struktūras ir blīvi iepakotas un pārklājas noteiktos dzīvo šūnu reģionos, to dinamiku un telpisko sadalījumu ir grūti analizēt. Fluorescences punktu mikroskopija (FSM) ir metode, kas ir saderīga ar gandrīz visām attēlveidošanas metodēm, kas izmanto ļoti zemas fluorescējoši iezīmētu apakšvienību koncentrācijas priekšrocības, samazina fluorescenci ārpus fokusa un uzlabo marķēto struktūru redzamību un to dinamiku biezos apgabalos. MFV tiek ieviesti, marķējot tikai daļu no visas interesējošās struktūras. Šajā ziņā FSM ir līdzīga FCS veikšanai visā redzes laukā, lai gan tā vairāk akcentē telpiskos modeļus, nevis kvantitatīvo laika analīzi. Fluorescējošo punktu mikroskopija ir īpaši noderīga, lai noteiktu citoskeleta elementu, piemēram, aktīna un mikrotubulu, mobilitāti un agregāciju hiperaktīvās šūnās.
Stimulētās emisijas samazināšanās mikroskopija (STED) ir jauna superizšķirtspējas tehnika ar telpisko izšķirtspēju, kas ievērojami pārsniedz difrakcijas robežu, izmantojot gredzenveida vāju gaismu, lai ieskautu mazāku ierosmes gaismas staru kūli, lai iegūtu sub-50 nm uz ass. rezolūciju. Metode balstās uz fluoroforu ierosmi ar sinhronizētiem lāzera impulsiem un telpiski koordinētiem apļveida STED impulsiem, kas samazina izstaroto gaismu, nomācot ierosināto molekulu fluorescenci ap lāzera skenēšanas fokusu. Plankuma perifērijā ģenerētā fluorescence tiek nomākta, bet ne plankuma centrā, tādējādi būtiski samazinot fluorescējošā plankuma izmēru un attiecīgi būtiski palielinot izšķirtspēju. STED ir izrādījies noderīgs rīks dzīvo šūnu noteikšanai ar augstu izšķirtspēju. Citas jaunas augstas izšķirtspējas metodes, piemēram, fotoaktivētā lokalizācijas mikroskopija (PALM) un strukturētā gaismas apgaismojuma mikroskopija (SIM), arī tuvākajā nākotnē kļūs par galvenajiem instrumentiem dzīvu šūnu attēlveidošanai.
Pieaugošā ģenētiski kodētu fluorescējošu proteīnu un progresīvu sintētisko fluoroforu izmantošana dzīvu šūnu attēlveidošanai paver durvis jaunām optiskām modalitātēm laika dinamikas un telpisko attiecību uzraudzībai. Mikroskopistiem tagad ir pilns rīku komplekts, lai novērotu un reģistrētu attēlu datus par šūnu procesiem, kas notiek plašā laika diapazonā un dažādās izšķirtspējās. Lēnākus notikumus var viegli novērot un reģistrēt, izmantojot lāzerskenējošo konfokālo mikroskopiju, savukārt ātrākus kinētiskos notikumus var iegūt, izmantojot rotējošā diska tehnoloģiju. Turklāt daudzfotonu mikroskopija nodrošina dziļu attēlveidošanu biezos audos, un kopējās iekšējās atstarošanas metodes ļauj zondēt membrānas virsmas ar konfokālu precizitāti. Uzlabotas fluorescences metodes, piemēram, FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM un STED, var izmantot, lai uzraudzītu proteīnu un olbaltumvielu mijiedarbību ar izšķirtspēju, kas bieži vien ir labāka nekā pieļauj difrakcijas robeža. Pateicoties fluorofora, mikroskopa un detektoru tehnoloģiju attīstībai, plašāka pasaule tiks "zem mikroskopa".
