Fluorescences mikroskopa darbības princips un uzbūve
Fluorescences mikroskops izmanto augstas gaismas efektivitātes punktveida gaismas avotu, kas izstaro noteiktu gaismas viļņa garumu (piemēram, ultravioleto gaismu 3650 collu vai violeti zilo gaismu 4200 collas) caur krāsu filtrēšanas sistēmu kā ierosmes gaismu un ierosina paraugā esošās fluorescējošās vielas, lai. izstaro dažādas fluorescences krāsas. Pēc tam to novēro, palielinot objektīvu un okulāru. Tādā veidā, pat ar vāju fluorescenci, tas ir viegli atpazīstams un ļoti jutīgs pie spēcīgiem kontrastējošiem foniem, ko galvenokārt izmanto šūnu struktūras un funkciju, kā arī ķīmiskā sastāva pētīšanai. Fluorescences mikroskopa pamatstruktūru veido parasts optiskais mikroskops un daži piederumi (piemēram, dienasgaismas gaismas avots, ierosmes filtrs, bihromatiskais staru atdalītājs un bloķējošais filtrs utt.). Luminiscences gaismas avoti – parasti izmanto īpaši augsta spiediena dzīvsudraba spuldzes (50-200W), kas spēj izstarot dažāda viļņa garuma gaismu. Tomēr katrai fluorescējošai vielai ir ierosmes gaismas viļņa garums, kas rada visspēcīgāko fluorescenci, tāpēc ir jāpievieno ierosmes filtri (parasti ultravioletie, purpursarkanie, zilie un zaļie ierosmes filtri), lai ļautu tikai noteiktam ierosmes gaismas viļņa garumam iziet cauri un apgaismot. paraugu, vienlaikus absorbējot visu pārējo gaismu. Pēc tam, kad tā ir apstarota ar ierosinātu gaismu, katra viela ļoti īsā laika periodā izstaro redzamu fluorescenci ar garāku viļņa garumu nekā apstarošana. Fluorescencei ir specifiskums, un tā parasti ir vājāka nekā ierosmes gaisma. Lai novērotu specifisku fluorescenci, aiz objektīva ir jāpievieno bloķējošs (vai nomācošs) filtrs. Tam ir divas funkcijas: pirmkārt, tā absorbē un bloķē ierosmes gaismas iekļūšanu okulārā, lai izvairītos no fluorescences traucēšanas un acu bojājumu; otrkārt, tas atlasa un ļauj iziet cauri noteiktai fluorescencei, parādot noteiktu fluorescences krāsu. Abu veidu filtri ir jāizvēlas lietošanai kopā.
Ir divu veidu fluorescences mikroskopi, kuru pamatā ir to optiskais ceļš:
1. Transmisijas fluorescences mikroskops: ierosmes gaismas avots tiek pārraidīts caur parauga materiālu caur kondensatoru, lai ierosinātu fluorescenci. Parasti izmantotos tumšā lauka gaismas kolektorus vai parastos gaismas kolektorus var izmantot, lai pielāgotu reflektoru, lai paraugā pārveidotu ierosmes gaismu un sānu gaismu. Šis ir salīdzinoši vecmodīgs fluorescences mikroskops. Tā priekšrocība ir tā, ka fluorescence ir spēcīga pie maza palielinājuma, savukārt tās trūkums ir tas, ka fluorescence vājinās, palielinoties palielinājumam. Tāpēc tas ir labāks lielāku paraugu materiālu novērošanai.
2. Krītošā stara fluorescences mikroskops Šis ir jauna veida fluorescences mikroskops, kas izstrādāts mūsdienās. Atšķirībā no iepriekšējās, ierosmes gaisma nokrīt no objektīva uz parauga virsmu, izmantojot to pašu objektīvu kā apgaismojuma kondensatoru un objektīva lēcu fluorescences savākšanai. Optiskajam ceļam, kas atrodas 45 grādu leņķī pret gaišo urānu, jāpievieno divu krāsu staru atdalītājs. Uzbudinājuma gaisma tiek atspoguļota objektīva lēcā un koncentrēta uz paraugu. Parauga radītā fluorescence, kā arī ierosmes gaisma, kas atstarojusies no objektīva lēcas un vāka stikla virsmas, vienlaicīgi nonāk objektīva lēcā un atgriežas dihromiskā stara separatorā, atdalot ierosmi un fluorescenci. Pēc tam atlikušo ierosmi absorbē bloķējošais filtrs. Ja tiek izmantoti dažādi ierosmes filtri/divkrāsu staru atdalītāji/bloķējošo filtru kombinācijas, tie var apmierināt dažādu fluorescējošu reakciju produktu vajadzības. Šī fluorescējošā mikroskopa priekšrocība ir tāda, ka redzes lauka apgaismojums ir vienmērīgs, attēls ir skaidrs un jo lielāks palielinājums, jo spēcīgāka ir fluorescence.
