Krāsošanas paņēmieni un mikroorganismu mikroskopiskā novērošana
1. Mērķis
1.1. Apgūstiet mikrobu uztriepes un krāsošanas pamatmetodes.
1.2. Apgūstiet vienkāršu baktēriju krāsošanas metodi.
1.3. Sākotnēji izprast baktēriju morfoloģiskās īpašības un nostiprināt zināšanas par eļļas lēcu lietošanu un aseptiskām darbības metodēm.
2 Principi
Baktēriju smērēšana un krāsošana ir mikrobioloģijas eksperimentu pamatmetode. Baktēriju šūnas ir mazas un caurspīdīgas, tādēļ tās ir grūti identificēt ar parastu gaismas mikroskopu; tiem jābūt notraipītiem. Baktēriju krāsošanai tiek izmantota viena krāsviela, lai iekrāsotās baktērijas veidotu skaidru krāsu atšķirību no fona, lai skaidrāk varētu novērot to morfoloģiju un struktūru. Šī metode ir viegli darbināma un piemērota baktēriju šūnu vispārējās formas un baktēriju izvietojuma novērošanai. Vienkāršai krāsošanai parasti izmanto pamata krāsvielas. Tas ir tāpēc, ka neitrālos, sārmainos vai vāji skābos šķīdumos baktēriju šūnas parasti ir negatīvi uzlādētas, un, jonizējot bāziskās krāsvielas, to molekulu krāsojošā daļa ir pozitīvi uzlādēta, tāpēc tās ir sārmainas. Krāsvielas krāsojošā daļa viegli savienojas ar baktērijām, lai tās iekrāsotu. Iekrāsotās baktēriju šūnas krasi kontrastē ar fonu, padarot tās vieglāk identificējamas zem mikroskopa. Krāsas, ko parasti izmanto vienkāršai krāsošanai, ir metilēnzilais, kristālvioletais, bāziskais fuksīns utt. Kad baktērijas sadala cukurus un ražo skābi, izraisot barotnes pH pazemināšanos, palielinās baktēriju pozitīvais lādiņš. Šobrīd krāsošanai var izmantot skābas krāsvielas, piemēram, eozīnu, skābo fuksīnu vai Kongo sarkano. Pirms krāsošanas baktērijas ir jānostiprina. Tam ir divi mērķi: viens ir iznīcināt baktērijas un likt tām pieķerties stikla priekšmetstikliņiem; otrs ir palielināt to afinitāti pret krāsvielām. Divas plaši izmantotas metodes ir karsēšana un ķīmiskā fiksācija. Nostiprinot, mēģiniet saglabāt sākotnējo šūnu formu.
3 materiāli
3.1. Baktērijas: Bacillus subtilis 12-18h barības agara slīpkultūra, Staphylococcus aureus 24h barības agara slīpā kultūra, Escherichia coli 24h barības agara slīpā kultūra, maizes rauga agara slīpā kultūra.
3.2. Krāsviela: Lu sārmainā metilēnzilā krāsviela (vai amonija oksalāta kristālvioletā krāsviela), karbolskābes fuksīna krāsviela.
3.3 Instrumenti vai citi piederumi: mikroskops, spirta lampa, priekšmetstikliņi, inokulācijas cilpa, priekšmetstikliņu statīvs, divslāņu pudele (satur ciedra eļļu un ksilolu), lēcu audi, fizioloģiskais sāls šķīdums vai destilēts ūdens utt.
4. Process: uztriepe → žāvēšana → fiksācija → krāsošana → mazgāšana → žāvēšana → mikroskopiskā izmeklēšana.
5 soļi
5.1. Uztriepes: paņemiet divus tīrus un eļļas nesaturošus stikla priekšmetstikliņus. Sterilos apstākļos uz katra priekšmetstikliņa centra uzlieciet nelielu pilienu parastā fizioloģiskā šķīduma (vai destilēta ūdens). Izmantojiet inokulācijas cilpu, lai sterilizētu baktērijas no Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus un Escherichia coli, ievelciet nedaudz baktēriju zāliena ūdens pilienos uz slīpuma, labi samaisiet un uzklājiet to plānā plēvē. Ja izmantojat baktēriju suspensijas (vai šķidrās kultūras) uztriepi, varat izmantot inokulācijas cilpu, lai izvēlētos 2 līdz 3 cilpas un uzklātu tās tieši uz priekšmetstikliņa. Uzmanieties, lai nenopilinātu pārāk daudz fizioloģiskā šķīduma (destilēta ūdens), izņemiet baktērijas un uzklājiet to vienmērīgi un ne pārāk biezi.
5.2. Žāvēšana Žāvējiet dabiski istabas temperatūrā. Varat arī nedaudz uzsildīt to virs spirta lampas ar pārklāto pusi uz augšu, lai to nožūtu. Taču noteikti nepiekļūstiet liesmai pārāk tuvu, jo pārāk augsta temperatūra iznīcinās baktēriju morfoloģiju.
5.3. Fiksācija Ja tiek izmantota karsētā žāvēšana, fiksācija un žāvēšana tiek apvienotas vienā solī, un metode ir tāda pati kā žāvēšana. Izsmērēt, nosusināt un termiski nostiprināt.
5.4. Krāsošana: novietojiet priekšmetstikliņu plakaniski uz priekšmetstikliņu paliktņa un pievienojiet 1 līdz 2 pilienus krāsvielu šķīduma uz uztriepes (krāsu šķīdumam ir lietderīgi tikai pārklāt uztriepes plēvi). Krāsojiet ar Lu pamata metilēnzilo 1 līdz 2 minūtes un krāsojiet ar karbolskābes fuksīnu (vai amonija oksalāta kristālvioletu) apmēram 1 minūti.
5.5 Mazgāšana ar ūdeni: nolejiet krāsvielu šķīdumu un uzmanīgi noskalojiet ar krāna ūdeni no viena priekšmetstikliņa gala, līdz ūdens, kas tek no uztriepes, ir bezkrāsains. Mazgājot ar ūdeni, nemazgājiet pārklāto virsmu tieši ar ūdeni. Ūdens plūsma nedrīkst būt pārāk ātra vai pārāk liela, lai novērstu uztriepes plēves nokrišanu.
5.6. Žāvēšana: Nokratiet ūdens pilienus uz priekšmetstikliņa un dabiski nosusiniet, nosusiniet ar fēnu vai uzsūciet ar absorbējošu papīru (uzmanieties, lai nenoslaucītu baktērijas). 5.7. Mikroskopiskā izmeklēšana Kad uztriepe ir nožuvusi, veiciet mikroskopisko izmeklēšanu. Pirms skatīšanās ar eļļas lēcu uztriepei jābūt pilnībā sausai.
6 Rezultāti Uzzīmējiet E. coli un Micrococcus luteus morfoloģiju, kas novērota pēc vienas krāsošanas.
