Galvenā optiskā mikroskopa novērošanas metode ir fluorescences novērošana
Fluorescences parādība
Fluorescence attiecas uz procesu, kurā fluorescējoša viela gandrīz vienlaikus izstaro gaismu ar garāku viļņa garumu, kad tā tiek apstarota ar noteikta viļņa garuma gaismu (1. attēls). Kad noteikta viļņa garuma (uzbudinājuma viļņa garuma) gaisma ietriecas molekulā (piemēram, molekulā fluoroforā), fotona enerģiju absorbē molekulas elektroni. Tālāk elektroni pāriet no pamatstāvokļa (S0) uz augstāku enerģijas līmeni, ierosmes stāvokli (S1'). Šo procesu sauc par ierosmi①. Elektrons paliek ierosinātā stāvoklī 10-9–10-8 sekundes, kuru laikā elektrons zaudē daļu enerģijas ②. Izejot no ierosinātā stāvokļa (S1) un atgriežoties pamatstāvoklī ③, tiks atbrīvota atlikušā enerģija, kas absorbēta ierosmes procesā.
Fluorescējošas molekulas uzturēšanās laiks ierosinātā stāvoklī ir fluorescences kalpošanas laiks, parasti nanosekundēs, kas ir pašas fluorescējošās molekulas raksturīga iezīme. Attēlveidošanas tehnoloģiju, izmantojot fluorescences kalpošanas laiku, sauc par fluorescences mūža attēlveidošanu (FLIM), kas papildus fluorescences intensitātes attēlveidošanai var veikt padziļinātus funkcionālus un precīzākus mērījumus, lai iegūtu molekulāro konformāciju, starpmolekulāro mijiedarbību un molekulāro mikrovidi. informāciju, ko ir grūti iegūt, izmantojot parasto optisko attēlveidošanu.
Vēl viena svarīga fluorescences īpašība ir Stoksa nobīde, viļņa garuma atšķirība starp ierosmes un emisijas maksimumiem (2. attēls). Parasti emisijas gaismas viļņa garums ir garāks par ierosmes gaismas viļņa garumu. Tas ir tāpēc, ka pēc fluorescējošās vielas ierosināšanas un pirms fotona atbrīvošanās elektroni relaksācijas procesā zaudēs daļu enerģijas. Fluorescējošas vielas ar lielākām Stoksa nobīdēm ir vieglāk novērot fluorescences mikroskopā.
Fluorescences mikroskopi un fluorescences filtru bloki
Fluorescences mikroskopija ir optiskais mikroskops, kas izmanto fluorescences īpašības, lai novērotu un attēlotu, un to plaši izmanto šūnu bioloģijā, neirobioloģijā, botānikā, mikrobioloģijā, patoloģijā, ģenētikā un citās jomās. Fluorescences attēlveidošanas priekšrocības ir augsta jutība un augsta specifika, un tā ir ļoti piemērota specifisku proteīnu, organellu utt. izplatības novērošanai audos un šūnās, līdzlokalizācijas un mijiedarbības izpētei, kā arī dzīves dinamikas izsekošanai. tādi procesi kā jonu koncentrācijas izmaiņas.
Lielākā daļa šūnu molekulu nefluorescē, un, lai tās redzētu, tām jābūt fluorescējoši marķētām. Ir daudzas fluorescējošās marķēšanas metodes, kuras var marķēt tieši (piemēram, izmantojot DAPI, lai marķētu DNS), vai imūnkrāsošanu, izmantojot antivielu antigēnu saistošās īpašības, vai mērķa proteīnu var marķēt ar fluorescējošiem proteīniem (piemēram, GFP, zaļo). fluorescējošs proteīns) vai atgriezeniska saistīšanās. sintētiskās krāsvielas (piemēram, Fura-2) utt.
Šobrīd fluorescences mikroskops ir kļuvis par standarta attēlveidošanas aprīkojumu dažādās laboratorijās un attēlveidošanas platformās, un tas ir labs palīgs mūsu ikdienas eksperimentos. Fluorescences mikroskopus galvenokārt iedala trīs kategorijās: vertikālie fluorescences mikroskopi (piemēroti sekciju griešanai), apgrieztās fluorescences mikroskopi (piemēroti dzīvām šūnām, ņemot vērā sekcijas), fluorescējošie stereoskopiskie mikroskopi (piemēroti lielākiem paraugiem, piemēram, augiem, zebraziviem (pieaugušajiem/ embrijs), medaka, peles/žurkas orgāni utt.).
Fluorescences filtra bloks ir mikroskopu fluorescences attēlveidošanas galvenā sastāvdaļa. Tas sastāv no ierosmes filtra, emisijas filtra un dihromiskā stara sadalītāja. Tas ir uzstādīts filtra ritenī, piemēram, Leica DMi8, kas aprīkots ar 6-pozīcijas filtra riteni (3. attēls). ). Dažādiem mikroskopiem ir dažādas riteņu pozīcijas, un daži mikroskopi izmanto filtru priekšmetstikliņus.
Filtra blokam ir svarīga loma fluorescences attēlveidošanā: ierosmes filtrs izvēlas ierosmes gaismu, lai ierosinātu paraugu, un bloķē citus gaismas viļņu garumus; gaisma, kas iet caur ierosmes filtru, iet cauri dihromiskam staru sadalītājam (tā uzdevums ir atspoguļot ierosmes gaismu un pārraidīt fluorescenci), pēc atstarošanas to fokusē objektīvs, apstaro uz paraugu, un atbilstošā fluorescence tiek ierosināta līdz izstaro gaismu. Izstarotā gaisma tiek savākta ar objektīva lēcu, iziet cauri dihromiskā stara sadalītājam un sasniedz emisijas filtru. Kā parādīts 4. attēlā: ierosmes viļņa garums ir 450-490 nm, dihromiskais staru sadalītājs atstaro gaismu, kas ir īsāks par 510 nm, raida gaismu, kas garāks par 510 nm, un emisijas gaismas uztveršanas diapazons ir 520-560 nm.
Fluorescences filtrus, ko parasti izmanto fluorescences mikroskopos, var iedalīt divos veidos: garā caurlaide (īsi LP) un joslas caurlaide (īsumā BP). Joslas caurlaidību parasti nosaka centrālais viļņa garums un intervāla platums, piemēram, 480/40, kas nozīmē, ka var tikt cauri gaisma no 460-500nm. Garās caurlaidības filtri, piemēram, 515 LP, izlaiž gaismu, kuras viļņu garums pārsniedz 515 nm (5. attēls).
Fluorescējošām vielām ir raksturīga ierosmes (absorbcijas) līkne un emisijas līkne, ierosmes maksimums ir ideāls ierosmes viļņa garums (augsta ierosmes efektivitāte, kas var samazināt ierosmes gaismas enerģiju, aizsargāt šūnas un krāsvielas), un emisijas līkne ir emisijas fluorescences viļņa garums. diapazons. Tāpēc eksperimentā mēs izvēlēsimies ierosmes viļņa garumu, kas ir pēc iespējas tuvāks ierosmes maksimumam, un uztveršanas diapazonā jāiekļauj emisijas maksimums. Piemēram, Alexa Fluor 488 ierosmes maksimums ir 500 nm, un fluorescences mikroskopā var izvēlēties ierosmes filtru 480/40.
Sīkāku informāciju par filtra kubiem var skatīt mikroskopa attēlveidošanas programmatūrā. Izpratne par krāsvielām un jūsu paraugam vislabāk atbilstošā filtra atrašana ir ļoti svarīga fluorescences attēlveidošanai. Fluorescējošo krāsvielu un fluorescējošo proteīnu spektrālā informācija parasti ir norādīta instrukcijās, un to var atrast arī tiešsaistē.
Papildus fluorescējošu zondu ierosmes un emisijas viļņu garumiem, izvēloties filtru blokus, jāņem vērā arī tas, vai ir nespecifiska ierosme un vai daudzkrāsu marķētiem paraugiem ir krusteniskā krāsa. Turklāt ir jāņem vērā izmantotais dienasgaismas gaismas avots. Pašlaik plaši izmantotie dienasgaismas gaismas avoti ir dzīvsudraba spuldzes, metālu halogenīdu spuldzes un LED gaismas avoti, kas pēdējos gados ir strauji attīstījušies. Luminiscences gaismas avota spektrs ir nepārtraukts vai pārtraukts, un enerģija dažādās viļņu garuma joslās būs atšķirīga. LED gaismas avots pakāpeniski kļūst par galveno fluorescences mikroskopa gaismas avotu, pateicoties tā salīdzinoši šaurajai spektra joslai, stabilākai enerģijas izvadei, ilgam kalpošanas laikam, drošākai un vides aizsardzībai un daudzām citām priekšrocībām.
Papildus mikroskopa iebūvētajam filtru blokam ir arī ārējais ātrais ritenis (7. attēls). Leica ārējam ātrajam ritenim blakus esošā filtra konversijas ātrums ir 27 ms, kas var realizēt ātrdarbīgus daudzkrāsu eksperimentus, piemēram, FRET un Fura2 attiecības kalcija attēlveidošanu. (8. att.) u.c.
Plašs fluorescences mikroskopijas attēlveidošanas metožu klāsts
Lai apmierinātu dažādas fluorescences attēlveidošanas vajadzības, papildus fluorescences mikroskopiem ir izstrādāti dažādi fluorescences mikroskopijas attēlveidošanas risinājumi:
Plaša lauka augstas izšķirtspējas attēlveidošanas sistēmas, piemēram, Leica THUNDER Imager, izmanto Leica novatorisko Clearing tehnoloģiju, lai attēlveidošanas laikā efektīvi noņemtu nefokālās plaknes traucējumu signālus, nodrošinot skaidrus attēlus un ātrdarbīgas attēlveidošanas priekšrocības;
Konfokālā lāzera skenēšanas mikroskopā tiek izmantoti caurumi, lai novērstu nefokālās plaknes traucējumus, tiek veikta optiskā sadalīšana un tiek iegūti augstas izšķirtspējas attēli un trīsdimensiju attēli;
Īpaši augstas izšķirtspējas mikroskopi un nanomikroskopi, kas pārkāpj difrakcijas robežu, var novērot smalkas struktūras, kas mazākas par 200 nm;
Daudzfotonu attēlveidošanas sistēma, kas izmanto daudzfotonu ierosmes principu biezu audu un dziļu in vivo attēlveidošanai;
Gaismas lokšņu attēlveidošanas tehnoloģija ar augstu laika un telpisko izšķirtspēju, ātru attēlveidošanas ātrumu, augstu izšķirtspēju, zemu fototoksicitāti, īpaši piemērota izstrādei un dinamiskai novērošanai in vivo;
Fluorescences mūža attēlveidošana (FLIM), ko neietekmē tādi faktori kā fluorescējošās vielas koncentrācija, fotobalināšana, ierosmes gaismas intensitāte utt., var veikt padziļinātākus funkcionālos un precīzākus mērījumus;
Fluorescences korelācijas spektroskopija (FCS) un fluorescences krusteniskās korelācijas spektroskopija (FCCS) mēra fluorescējošu molekulu molekulāro skaitu un difūzijas koeficientu, tādējādi analizējot molekulu koncentrāciju, molekulu izmēru, viskozitāti, molekulu kustību, molekulu saistīšanos/disociāciju, un molekulu optiskās īpašības;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF) ar ārkārtīgi augstu z-ass izšķirtspēju ir ideāli piemērota šūnu membrānu virsmu molekulārās struktūras un dinamikas izpētei.
