Divu fotonu fluorescences mikroskopijai ir daudz priekšrocību:
1) Garākus gaismas viļņu garumus izkliede ietekmē mazāk nekā īsākus gaismas viļņu garumus, lai iekļūtu paraugā;
(2) Fluorescējošās molekulas ārpus fokusa plaknes netiek ierosinātas, lai vairāk ierosmes gaismas varētu sasniegt fokusa plakni, lai ierosmes gaisma varētu iekļūt dziļāk paraugā;
3) garāki tuvās infrasarkanās gaismas viļņi ir mazāk toksiski šūnām nekā īsāki viļņu garumi;
4) Ja parauga novērošanai izmanto divu fotonu mikroskopu, fotobalināšana un fototoksicitāte ir tikai fokusa plaknē. Tāpēc divu fotonu mikroskopi ir piemērotāki nekā viena fotona mikroskopi biezu paraugu novērošanai, dzīvo šūnu novērošanai vai plankumu fotobalināšanas eksperimentu veikšanai.
Konfokālās fluorescences mikroskopa zināšanas
Konfokālās fluorescences mikroskopa pamatprincips: parauga apstarošanai tiek izmantots punktveida gaismas avots, veidojot nelielu, labi definētu gaismas punktu fokusa plaknē. Fluorescenci, kas izstaro no šī punkta pēc apstarošanas, savāc objektīva lēca un nosūta atpakaļ uz staru sadalītāju, kas sastāv no divvirzienu hromatiskā spoguļa pa sākotnējo apstarošanas gaismas ceļu. Staru sadalītājs nosūta fluorescenci tieši uz detektoru. Gan gaismas avotam, gan detektoram priekšā ir caurums, ko attiecīgi sauc par apgaismojuma caurumu un noteikšanas caurumu. Abiem ir vienāda ģeometrija, apmēram 100-200 nm, un tie ir konjugēti attiecībā pret gaismas punktu fokusa plaknē, ti, gaismas punkts iet cauri virknei lēcu un galu galā var tikt fokusēts uz abiem apgaismojošajiem objektiem. un detektoru caurumiem. Tādā veidā gaisma no fokusa plaknes var saplūst zondes atvērumā, savukārt izkliedētā gaisma no augšas vai zem fokusa plaknes tiek bloķēta ārpus zondes apertūras un to nevar attēlot. Lāzers skenē paraugu punktu pa punktam, un fotopavairotāja caurule pēc cauruma noteikšanas iegūst arī atbilstošā gaismas punkta konfokālo attēlu punktu pa punktam, kas tiek pārveidots digitālā signālā un pārraidīts uz datoru, un visbeidzot saplūst skaidrā. visas fokusa plaknes konfokālais attēls ekrānā.
Katrs fokusa plaknes attēls faktiski ir parauga optiskais šķērsgriezums, un šim optiskajam šķērsgriezumam vienmēr ir noteikts biezums, ko sauc arī par optisko loksni. Tā kā gaismas intensitāte fokusa punktā ir daudz lielāka nekā nefokusa punktā un nefokālās plaknes gaismu filtrē caurums, konfokālās sistēmas lauka dziļums tiek tuvināts nullei, un skenēšana Z-ass virzienā ļauj optiskajai tomogrāfijai veidot parauga divdimensiju optisko šķēli, ko var novērot fokusa vietā. Apvienojot XY plaknes (fokālās plaknes) skenēšanu ar Z-ass (optiskās ass) skenēšanu, parauga trīsdimensiju attēlu var iegūt, akumulējot secīgus divdimensiju attēlu slāņus, kurus apstrādā specializēta datorprogramma.
Tas nozīmē, ka noteikšanas caurums un gaismas avota caurums vienmēr ir fokusēti vienā punktā, lai ārpus fokusa plaknes ierosinātā fluorescence nevarētu iekļūt noteikšanas caurumā.
Lāzera konfokāla darbības princips ir vienkārši izteikts, ka tas izmanto lāzeru kā gaismas avotu, pamatojoties uz tradicionālo fluorescences mikroskopa attēlveidošanu, papildu lāzerskenēšanas ierīci un konjugāta fokusēšanas ierīci, izmantojot datora vadību, lai veiktu digitālo attēlu iegūšanas un apstrādes sistēmu.
