Izpratne par konfokālās fluorescences mikroskopiju
Konfokālās fluorescences mikroskopijas pamatprincips: izmantojiet punktveida gaismas avotu, lai apgaismotu paraugu, veidojot nelielu, labi definētu gaismas punktu fokusa plaknē. Punkta izstarotā fluorescence pēc apgaismojuma tiek savākta ar objektīva lēcu un tiek atgriezta dihromiskajā spogulī pa sākotnējo apgaismojuma gaismas ceļu. veido staru sadalītāju. Spektrometrs nosūta fluorescenci tieši uz detektoru. Gaismas avota un detektora priekšā ir caurums, ko attiecīgi sauc par apgaismojuma caurumu un noteikšanas caurumu. Abu ģeometriskie izmēri ir konsekventi, aptuveni 100-200nm; attiecībā pret gaismas punktu fokusa plaknē abi ir konjugēti, tas ir, gaismas punkts iziet cauri virknei lēcu un galu galā var tikt fokusēts uz apgaismojuma caurumu un noteikšanas adatas caurumu vienlaikus. Tādā veidā gaismu no fokusa plaknes var koncentrēt noteikšanas cauruma diapazonā, savukārt izkliedētā gaisma no augšas vai zem fokusa plaknes tiek bloķēta ārpus noteikšanas cauruma un to nevar attēlot. Paraugs tiek skenēts punkts punktā ar lāzeru, un fotopavairotāja caurule, kas atrodas aiz detektēšanas cauruma, punktu pa punktam iegūst arī atbilstošā gaismas punkta konfokālo attēlu, kas tiek pārveidots digitālā signālā un nosūtīts uz datoru, un visbeidzot tiek apkopots ekrāns pārvēršas skaidrā visas fokusa plaknes konfokālā attēlā. .
Katrs fokusa plaknes attēls faktiski ir parauga optiskais šķērsgriezums. Šim optiskajam šķērsgriezumam vienmēr ir noteikts biezums, un to sauc arī par optisko plāno šķērsgriezumu. Tā kā gaismas intensitāte fokusā ir daudz lielāka par gaismas intensitāti nefokusā, un nefokālās plaknes gaismu filtrē caurums, konfokālās sistēmas lauka dziļums ir aptuveni nulle. Skenējot pa Z-ass virzienu, var realizēt optisko tomogrāfiju, veidojot vēlamo. Novērojiet divdimensiju optisko sekciju parauga fokusētajā vietā. Apvienojot XY plaknes (fokālās plaknes) skenēšanu ar Z-ass (optiskās ass) skenēšanu, uzkrājot nepārtrauktus divdimensiju attēlu līmeņus un apstrādājot tos ar specializētu datorprogrammu, var iegūt parauga trīsdimensiju attēlu.
Tas nozīmē, ka noteikšanas caurums un gaismas avota caurums vienmēr ir fokusēti uz vienu un to pašu punktu, lai ārpus fokusa plaknes ierosinātā fluorescence nevarētu iekļūt noteikšanas caurumā.
Vienkāršā lāzera konfokālā darbības principa izpausme ir tāda, ka tas izmanto lāzeru kā gaismas avotu. Pamatojoties uz tradicionālo fluorescences mikroskopa attēlveidošanu, tiek pievienota lāzerskenēšanas ierīce un konjugāta fokusēšanas ierīce, un sistēmu kontrolē dators, lai savāktu un apstrādātu digitālos attēlus.
