Šūnu izpētes mikroskopu klasifikācija un darbība
Mikroskops ir galvenais rīks šūnu novērošanai. Atkarībā no dažādiem gaismas avotiem to var iedalīt divās kategorijās: optiskie mikroskopi un elektronu mikroskopi. Pirmais izmanto redzamo gaismu (UV mikroskopi izmanto ultravioleto gaismu) kā gaismas avotu, bet otrais izmanto elektronu starus kā gaismas avotu.
-,Optiskais mikroskops
(1) Parasts optiskais mikroskops
Parastie bioloģiskie mikroskopi sastāv no trim daļām, proti: ① apgaismojuma sistēma, ieskaitot gaismas avotu un kondensatoru; ② optiskā palielinājuma sistēma, kas sastāv no objektīva un okulāra, kas ir mikroskopa galvenais korpuss. Lai novērstu sfērisko aberāciju un hromatisko aberāciju, gan okulārs, gan objektīvs ③ Mehāniskā ierīce, ko izmanto materiāla nostiprināšanai un novērošanas atvieglošanai (attēls 2-1).
To, vai mikroskopa attēls ir skaidrs, nosaka ne tikai palielinājums, bet arī tas ir saistīts ar mikroskopa izšķirtspēju. Izšķirtspēja attiecas uz mikroskopa (vai cilvēka acs 25 cm attālumā no mērķa) spēju atšķirt mazāko attālumu starp objektiem. Izšķirtspējas lielumu nosaka gaismas viļņa garuma un apertūras attiecību un vides refrakcijas indeksu izsaka ar formulu:
Formulā: n=vides refrakcijas indekss;=diafragmas atvēruma leņķis (parauga atvēršanas leņķis pret objektīva objektīva apertūru), NA=objektīva apertūra (skaitliskā apertūra). Objektīva leņķis vienmēr ir mazāks par 180 grādiem, tāpēc maksimālajai sina/2 vērtībai jābūt mazākai par 1.
Optisko lēcu izgatavošanai izmantotā stikla laušanas koeficients ir no 1,65 līdz 1,78, un izmantotās vides refrakcijas koeficients ir tuvāk stiklam, jo labāk. Sausām objektīvu lēcām vide ir gaiss, un objektīva apertūras attiecība parasti ir 0.05 līdz 0,95; eļļas lēcām kā barotne tiek izmantota ciedra eļļa, un objektīva apertūras attiecība var būt tuvu 1,5.
Parastās gaismas viļņa garums ir {{0}}nm, tāpēc mikroskopa izšķirtspējas vērtība nebūs mazāka par 0,2 μm, un cilvēka acs izšķirtspēja ir 0,2 mm, tāpēc vispārējā mikroskopa konstrukcijas maksimālais palielinājums parasti ir 1000X.
(2) Fluorescences mikroskopija
Dažas vielas šūnās, piemēram, hlorofils, var fluorescēt pēc ultravioleto staru apstarošanas; dažas vielas pašas nevar fluorescēt, bet, ja tās ir iekrāsotas ar fluorescējošām krāsvielām vai fluorescējošām antivielām, tās var fluorescēt arī ultravioleto staru apstarojot, un fluorescences mikroskops (2-2, 3., 4. att.) ir viens no instrumentiem. šādu vielu kvalitatīviem un kvantitatīviem pētījumiem.
Fluorescences mikroskopiem un parastajiem mikroskopiem ir šādas atšķirības:
1. Apgaismošanas metode parasti ir epi-apgaismojums, tas ir, gaismas avots tiek projicēts uz parauga caur objektīva lēcu (attēls 2-3);
2. Gaismas avots ir ultravioletā gaisma, viļņa garums ir īsāks un izšķirtspēja ir augstāka nekā parastajiem mikroskopiem;
3. Ir divi speciāli filtri, viens gaismas avota priekšā tiek izmantots, lai filtrētu redzamo gaismu, un tas, kas atrodas starp okulāru un objektīvu, tiek izmantots ultravioletās gaismas filtrēšanai, lai aizsargātu acis.
(3) Lāzerskenējošs konfokālais mikroskops
Lāzera konfokālais skenēšanas mikroskops (lāzera konfokālais skenēšanas mikroskops, attēls 2-5, 6) izmanto lāzeru kā skenējošu gaismas avotu un skenē attēlveidošanu punktu pēc punkta, līniju pēc līnijas, virsmu pēc virsmas, un skenēšanas lāzera un fluorescences kolekcija ir kopīga objektīva lēca, un objektīva fokuss ir Skenējošā lāzera fokusa punkts ir arī momentānās attēlveidošanas objekta punkts. Tā kā lāzera stara viļņa garums ir īss un stars ir ļoti plāns, konfokālajam lāzera skenēšanas mikroskopam ir augstāka izšķirtspēja, kas ir aptuveni 3 reizes lielāka nekā parastajam optiskajam mikroskopam. Sistēma tiek fokusēta vienreiz, un skenēšana tiek ierobežota līdz vienai parauga plaknei. Ja fokusēšanas dziļums ir atšķirīgs, var iegūt dažādu parauga dziļuma līmeņu attēlus. Šī attēla informācija tiek saglabāta datorā. Izmantojot datoru analīzi un simulāciju, var parādīt šūnas parauga trīsdimensiju struktūru.
Konfokālo lāzerskenējošo mikroskopiju var izmantot ne tikai šūnu morfoloģijas novērošanai, bet arī intracelulāro bioķīmisko komponentu kvantitatīvai analīzei, optiskā blīvuma statistikai un šūnu morfoloģijas mērīšanai.
(4) Tumšā lauka mikroskops
Tumšā lauka mikroskopam (tumšā lauka mikroskopam, attēls 2-7) ir gaismas loksne kondensatora centrā, lai apgaismojuma gaisma tieši nenonāktu cilvēka objektīvā, bet tikai gaisma, ko atstaro un izkliedē paraugs. ir atļauts iekļūt objektīva objektīvā, tāpēc redzes lauka fons ir melns, Objektu malas ir spilgtas. Izmantojot šo mikroskopu, var redzēt tik mazas daļiņas kā 4-200nm, un izšķirtspēja var būt 50 reizes lielāka nekā parastajiem mikroskopiem.
(5) Fāzes kontrasta mikroskops
P. Zernikas fāzu kontrasta mikroskops (fāzu kontrasta mikroskops, 2-8., 9. attēls) tika izgudrots 1932. gadā un 1953. gadā par to ieguva Nobela prēmiju fizikā. Šī mikroskopa lielākā iezīme ir tā, ka tas var novērot nekrāsotus paraugus un dzīvas šūnas.
Fāzu kontrasta mikroskopijas pamatprincips ir mainīt caur paraugu ejošo redzamās gaismas optiskā ceļa atšķirību amplitūdas starpībā, tādējādi uzlabojot kontrastu starp dažādām struktūrām un padarot dažādas struktūras skaidri redzamas. Pēc tam, kad gaisma iziet cauri paraugam, tā tiek lauzta, novirzīta no sākotnējā optiskā ceļa un aizkavēta par 1/4λ (viļņa garums). Stiprināt, palielināt vai samazināt amplitūdu, palielināt kontrastu. Struktūras ziņā fāzu kontrasta mikroskopiem ir divas īpašas iezīmes, kas atšķiras no parastajiem optiskajiem mikroskopiem:
1. Gredzenveida diafragma atrodas starp gaismas avotu un kondensatoru, un tās funkcija ir panākt, lai gaisma, kas iet cauri kondensatoram, veidotu dobu gaismas konusu un fokusētos uz paraugu.
2. Fāzes plāksne (gredzenveida fāzes plāksne) pievieno fāzes plāksni, kas pārklāta ar magnija fluorīdu objektīva lēcā, kas var aizkavēt tiešās gaismas vai difrakcijas gaismas fāzi par 1/4λ. Ir divi veidi:
①A plus fāzes plāksne: tiešā gaisma tiek aizkavēta par 1/4λ. Pēc abu gaismas viļņu grupu apvienošanas gaismas viļņi tiek summēti un amplitūda tiek palielināta. Parauga struktūra ir gaišāka nekā apkārtējā vidē, veidojot spilgtu kontrastu (vai negatīvu kontrastu).
② B plus fāzes plāksne: izkliedētā gaisma tiek aizkavēta par 1/4λ. Pēc abu staru kopu apvienošanas gaismas viļņi tiek atņemti, un amplitūda kļūst mazāka, veidojot tumšu kontrastu (vai pozitīvu kontrastu), un struktūra ir tumšāka par apkārtējo vidi.
