Atšķirības un īpašības starp fluorescences mikroskopiem un parastajiem optiskajiem mikroskopiem
Fluorescences mikroskops atšķiras no parastā optiskā mikroskopa ar to, ka tas nenovēro paraugus parastu gaismas avotu apgaismojumā. Tā vietā tas izmanto noteiktu gaismas viļņa garumu (parasti ultravioleto gaismu, zili violeto gaismu), lai mikroskopā ierosinātu paraugā esošās fluorescējošās vielas, liekot tām izstarot fluorescenci. Tāpēc gaismas avota loma fluorescences mikroskopā nav tiešs apgaismojums, bet gan kā enerģijas avots, kas ierosina paraugā esošās fluorescējošās vielas. Iemesls, kāpēc mēs varam novērot paraugus, nav saistīts ar gaismas avota apgaismojumu, bet gan fluorescences fenomenu, ko uzrāda fluorescējošās vielas parauga iekšpusē pēc ierosinātās gaismas enerģijas absorbēšanas. No tā var redzēt, ka fluorescences mikroskopijas īpašība galvenokārt ir tāda, ka tās gaismas avots var nodrošināt lielu ierosmes gaismas daudzumu noteiktā viļņu garuma diapazonā, lai paraugā esošās fluorescējošās vielas varētu iegūt nepieciešamo ierosmes gaismas intensitāti. Tajā pašā laikā fluorescences mikroskopiem jābūt atbilstošām filtru sistēmām. Fluorescences mikroskops ir būtisks instruments fluorescences audu ķīmijā. Tas sastāv no galvenajām sastāvdaļām, piemēram, īpaši-augstsprieguma gaismas avota, filtru sistēmas (tostarp ierosmes un slāpēšanas filtra plāksnēm), optiskās sistēmas un fotografēšanas sistēmas. Tas izmanto noteikta viļņa garuma gaismu, lai ierosinātu paraugu un izstaro fluorescenci.
1. Fluorescences ierosmes metodes: Atkarībā no gaismas viļņa garuma diapazona ir divi veidi: UV ierosmes metode (izmantojot ultravioleto apgaismojumu) un BV ierosmes metode (izmantojot zilo violeto gaismu). UV ierosmes metode ierosināšanai izmanto tuvu ultravioleto gaismu, kas ir īsāka par 400 nm. Šai metodei nav redzamas ierosmes gaismas, tāpēc novērotā fluorescence parāda krāsvielai raksturīgo fluorescenci, kas ļauj viegli atšķirt parauga īpašo fluorescenci no fona audu pašfluorescences.
2. BV ierosmes metode: tā ietver ierosmi no ultravioletās gaismas līdz zilai gaismai, kuras centrs ir 404 nm un 434 nm. Izmantojot šo metodi, parauga apstarošanai tiek izmantota zilā gaisma, tāpēc fluorescences novērošanas sistēmas{4}}nogrieztajam filtram ir jāizmanto filtrs, kas var pilnībā bloķēt zilo gaismu un pilnībā iziet cauri vajadzīgajai zaļajai un dzeltenajai fluorescencei. Fluorescējošie pigmenti, ko izmanto fluorescējošu antivielu metodei. Ierosinājuma gaismas maksimālais absorbcijas viļņa garums un fluorescences maksimālais emisijas viļņa garums ir relatīvi tuvu, tāpēc BV ierosmes metodē izmantotajam filtram ir jāizmanto asu griezuma filtrs. Šī metode var izmantot zilo gaismu kā ierosmes gaismu, tāpēc fluorescējošu pigmentu absorbcijas efektivitāte ir augsta un var iegūt gaišākus attēlus. Trūkums ir tāds, ka fluorescence zem 500 nm nav redzama, savukārt fluorescence virs 500 nm padara visu attēlu dzeltenu. Fluorescējošo antivielu metodē specifiku galvenokārt nosaka fluorescējošiem pigmentiem raksturīgā krāsa, tāpēc, apspriežot smalko specifiku, iepriekš minētie BV ierosmes metodes trūkumi bieži vien būtiski ietekmē.
