Cik daudz jūs zināt par fluorescences mikroskopiju
Fluorescences mikroskopi parasti izmanto augstas intensitātes dzīvsudraba lampas kā ierosmes gaismas avotus. Filtri tiek izmantoti, lai filtrētu nevēlamu gaismu, atstājot tikai augstas intensitātes, tīru gaismu, kas ierosina fluoroforu. Pēc tam, kad monohromatiskā gaisma izstaro paraugu caur objektīva lēcu, paraugs tiks ierosināts, lai izstarotu gaismu (fluorescence), un gan fluorescence, gan ierosmes gaisma atgriezīsies pa objektīva lēcas optisko ceļu. Šajā gadījumā ierosmes gaismas filtrēšanai ir nepieciešams dihromisks spogulis. , ļaujot redzēt tikai fluorescenci, kas mums ir nepieciešama.
Šī fluorescence sasniedz okulāru pa mikroskopa gaismas ceļu un pēc tam nonāk mūsu acīs, kur mēs varam redzēt fluorofora izstaroto fluorescenci.
Fluorescences mikroskopa iepriekšēja pārbaude un regulēšana:
(1) Pirms katra fluorescences novērojuma regulāri jāpārbauda fluorescences ierīces kvēldiega izlīdzinājums, optiskā ceļa fokuss, apertūras diafragma un lauka diafragmas iestatījumi.
(2) Vai pārveidotājā ir uzstādīts nepieciešamais fluorescences ierosmes/emisijas filtra komplekts, vai fluorescences mikroskopa objektīva lēca ir pareizi konfigurēta, un noņemiet eļļas traipus un putekļus no objektīva priekšējās lēcas.
(3) Ja vienlaikus tiek veikta caurlaidīgās gaismas fāzes kontrasta novērošana, ir jāpārbauda kondensatora centra un fāzes kontrasta gredzena konjugācija pretī objektīvam.
(4) Pārbaudiet, vai parauga turētājs (slaids stikls, pārsegu stikls un citi piederumi) ir pārklāts ar šķidrumu vai putekļiem un vai biezums ir objektīva lēcas kalibrētā darba attāluma diapazonā. Sagrieztais paraugs nedrīkst būt pārāk biezs, vēlams, mazāks par 10 μm vai vienāds ar to.
(5) Tā kā apgaismojuma avots satur ultravioletos starus, virs skatuves priekšpuses ir novietota brūna gaismas aizsargplāksne, lai ultravioletie stari nesabojātu tīkleni.
(6) Sprieguma nestabilitāte samazinās augstspiediena dzīvsudraba spuldzes kalpošanas laiku, un gaismas avota barošanas avots ir aprīkots ar sprieguma stabilizatoru.
(7) Lai pagarinātu dzīvsudraba lampas kalpošanas laiku, to var izslēgt 15 minūtes pēc ieslēgšanas; kad dzīvsudraba spuldzes fluorescējošā jauda ir izslēgta, tai ir jāgaida vismaz 10 minūtes, lai dzīvsudraba tvaiki atsāktu, lai atdziestu un atgrieztos sākotnējā stāvoklī, pretējā gadījumā tiks ietekmēts lampas kalpošanas laiks.
Attēla novērošana ar fluorescences mikroskopu:
(1) Apmēram 5-10 minūtes pēc dienasgaismas gaismas avota ieslēgšanas ierosmes gaismas intensitātei ir tendence būt stabilai, un paraugs tiek ielādēts novērošanai; lai novērstu parauga fluorescences slāpēšanu, ko izraisa pārmērīga ierosmes gaisma fokusēšanas un objektu meklēšanas procesā, vispirms tāliniet fluorescences mikroskopu. Noregulējiet ierosmes gaismu uz mērenu intensitāti ar diafragmas diafragmu vai pievienojiet ND filtru, un regulāri pārvietojiet parauga posmu. Pēc spoguļattēla apstiprināšanas fotografēšanai un ierakstīšanai pielāgojiet fluorescējošu stāvokli.
(2) Pielāgojumi sliktai attēla kvalitātei. Papildus paraugu sagatavošanas faktoriem var veikt šādas nepieciešamās korekcijas:
① Izslēdziet attēlveidošanas optiskajā ceļā gaismu aizsargājošas vai gaismu ierobežojošas ierīces, piemēram, DIC piederumus, ND filtrus utt.
② Pārregulējiet fluorescences mikroskopa uztvērēja fokusu un diafragmas diafragmas izmēru.
③ Uzmanīgi noregulējiet fluorescences mikroskopa objektīva pārklājuma atšķirības korekcijas gredzenu.
Fluorescences mikroskopijas pielietošanas punkti
Fluorescences mikroskopijā tiek izmantota "aktīniskās fluorescences" attēlveidošana. Ja izvēlētais ierosmes viļņa garums atrodas gandrīz ultravioletajā apgabalā (320-400nm), kas ir neredzams ar neapbruņotu aci, arī fluorescences emisijas spektrs ir īsāks par parasto gaismas spoguļa gaismas avotu vidējo viļņa garumu. uzlabot. Augstas enerģijas fotoni saduras ar elektroniem, izraisot elektronu pāreju no pamata stāvokļa uz ierosināto stāvokli. Elektroni ierosinātajā stāvoklī ir ļoti nestabili un atgriezīsies pamata stāvoklī. Šajā procesā tiks patērēta daļa siltumenerģijas un tiks emitēti jauni fotoni. Jaunajam fotonam ir mazāka enerģija nekā sākotnējam fotonam, un tāpēc tam ir garāks viļņa garums. Tā kā jaunais fotona viļņa garums atšķiras no krītošās gaismas fotona viļņa garuma, divi gaismas stari ar dažādu viļņu garumu tiek atdalīti ar noteiktu optiskās apstrādes metodi, lai mēs redzētu tikai izstarotos jaunos fotonus (fluorescences signālu), tas ir, fluorescences mikroskops redz fluorescences attēlus.
