Lāzera konfokālā mikroskopija — funkcijas un pielietojums
Lāzerskenējošā konfokālā mikroskopija (LSCM) ir mikroskopa veids, kas izstrādāts, pamatojoties uz konjugāta fokusa tehnoloģiju, tas ir, lāzera gaismas avots, mēramais paraugs un detektors atrodas viens ar otru konjugētā pozīcijā.
Fundamentāls
Vispārējā mikroskopā novērošanas attēla plakne ir izolēta no blakus esošās aksiālās plaknes, sakrītot objektīva lēcas fokusa plaknei ar detektoru, savukārt konfokālajā mikroskopā parauga apgaismošanai izmanto gaismas punktu ar ierobežotu difrakciju un A pinhole tiek izmantots savāktajā gaismas ceļā pie gaismas punkta konjugētā fokusa, lai filtrētu izkliedētu gaismu, lai radītu šo izolācijas efektu un tādējādi uzlabotu izšķirtspēju.
Attēlveidošanas funkcijas
Optisko sekciju skenēšanas attēlveidošana
Vēl viena lāzera skenēšanas konfokālās mikroskopijas iezīme ir tā, ka tā ir skenēšanas attēlveidošanas tehnoloģija. Tradicionālā plata lauka apgaismojuma tehnoloģija apgaismo visu paraugu, tāpēc attēlu var uzņemt tieši ar neapbruņotu aci vai detektoru, bet LSCM izmanto staru kūli vai vairākus fokusētus starus, kas iziet cauri paraugam, lai skenētu un attēlotu. Iegūto attēlu sauc par optisko sekciju. Tālāk ir parādīta atšķirība starp tradicionālo plaša lauka apgaismojuma metodi un lāzerskenēšanas konfokālā apgaismojuma metodi.
Tāpēc mūsdienu konfokālā mikroskopa faktiskā darba metode ir tāda, kā parādīts zemāk esošajā attēlā. Lāzera izstarotā ierosmes gaisma iziet cauri dihromiskajam spoguli un tiek skenēta parauga x un y virzienā caur galvanometru pāri. Parauga ierosme (vai atstarošana) ir Gaisma caur caurumu iekļūst PMT detektorā un tiek ierakstīta, un ierakstītais skenētais attēls tiek rekonstruēts ar datoru, lai rekonstruētu faktisko parauga attēlu.
Ģenerējiet "z-stack" attēlus dažādās fokusa plaknēs
Tikai no konjugētā parauga slāņa atstarotā gaisma var iziet cauri mazajam caurumam savākšanas gaismas ceļā, un mazais caurums bloķē atlikušos neatbilstošos parauga slāņa atstarojumus. Tas var radīt ievērojamus izšķirtspējas uzlabojumus. Viena un tā paša bieza parauga daudzdimensiju fluorescences mikroskopijas un konfokālās mikroskopijas salīdzinājums. Ja attēlu sērija tiek uzņemta dažādās fokusa plaknēs, var tikt ģenerēti attēli, ko parasti dēvē par "z-stacks", kas ilustrē konfokālās mikroskopijas piedāvāto izšķirtspējas un kontrasta pieaugumu un šo ieguvumu pamatcēloņus. Var redzēt, ka, pārbaudot attēlu kaudzes augšpusē ar attēlveidošanas plakni virs audiem, fluorescences attēlā atklājas liels daudzums izkliedētas gaismas, savukārt konfokālās mikroskopijas attēls šķiet melns. Šis aksiālā PŠŠ samazinājums tieši rada izšķirtspējas atšķirību, kas novērota optiskajā saskarnē z-skursteņa vidū.
Izšķirtspēja ir ievērojami uzlabota salīdzinājumā ar platlauka apgaismojumu
Fluorescences mikroskopijā gaismas intensitāti, kas izstaro no viena punkta, apraksta ar punktu izkliedes funkciju (PSF), un tās modelis ir Airy disks. Fluorescences sistēmas izšķirtspēju var raksturot ar Airy diska rādiusu, ko var raksturot ar Objektīva lēcas skaitlisko apertūru un ierosmes gaismas viļņa garumu nosaka
